Ensaio de Atividade de Citrato Sintase: Um Ensaio Colorimétrico para Medir a Atividade da Citrato Sintase Mitocondrial em Homogenato de Tecido de Drosophila

Dentro das mitocôndrias, a citrato sintase, localizada na matriz da membrana mitocondrial interna, é a enzima limitante da taxa que catalisa a reação entre a acetil coenzima A e o ácido oxaloacético para formar citrato, a primeira etapa do ciclo do ácido cítrico.

Para analisar a atividade da citrato sintase, transfira tórax de mosca de Drosophila adulta abundante nas mitocôndrias para um tubo preenchido com um tampão de extração resfriado contendo ácido etilenodiaminotetracético, EDTA e um detergente não iônico.

Homogeneizar os tecidos do tórax no gelo para evitar a desnaturação de proteínas mediada pelo calor. A força de cisalhamento aplicada, em conjunto com os detergentes, lisa o tecido e libera componentes intracelulares, incluindo mitocôndrias.

Além disso, a ruptura da membrana mitocondrial interna leva à liberação de proteínas da matriz mitocondrial, incluindo a citrato sintase. O EDTA se liga a cátions divalentes e inibe a atividade da protease, evitando assim a degradação da proteína.

Diluir o homogenato utilizando tampão de extracção e adicionar um volume adequado à mistura de reacção que contém os alvéolos da placa de poços múltiplos. A mistura de reação compreende acetil