Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:44 min. • July 8th, 2025
Dentro das mitocôndrias, a citrato sintase, localizada na matriz da membrana mitocondrial interna, é a enzima limitante da taxa que catalisa a reação entre a acetil coenzima A e o ácido oxaloacético para formar citrato, a primeira etapa do ciclo do ácido cítrico.
Para analisar a atividade da citrato sintase, transfira tórax de mosca de Drosophila adulta abundante nas mitocôndrias para um tubo preenchido com um tampão de extração resfriado contendo ácido etilenodiaminotetracético, EDTA e um detergente não iônico.
Homogeneizar os tecidos do tórax no gelo para evitar a desnaturação de proteínas mediada pelo calor. A força de cisalhamento aplicada, em conjunto com os detergentes, lisa o tecido e libera componentes intracelulares, incluindo mitocôndrias.
Além disso, a ruptura da membrana mitocondrial interna leva à liberação de proteínas da matriz mitocondrial, incluindo a citrato sintase. O EDTA se liga a cátions divalentes e inibe a atividade da protease, evitando assim a degradação da proteína.
Diluir o homogenato utilizando tampão de extracção e adicionar um volume adequado à mistura de reacção que contém os alvéolos da placa de poços múltiplos. A mistura de reação compreende acetil coenzima A, ácido oxaloacético e ácido ditionitrobenzóico.
A citrato sintase no homogeneizado catalisa a reação entre o ácido oxaloacético e a acetil coenzima A, formando citrato e coenzima A com um grupo tiol. O grupo tiol reage com o ácido ditionitrobenzóico incolor, formando um produto amarelo, o ácido tionitrobenzóico.
Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância da solução de cor amarela. A absorbância pode estar relacionada à atividade da citrato sintase no homogeneizado tecidual.
Transfira 10 tórax de mosca adulta para 100 microlitros de tampão de extração gelada imediatamente e homogeneize-os com um pilão no gelo. Mantenha as amostras frias homogeneizando por cinco a 10 segundos no gelo, deixando-as descansar no gelo por cinco segundos e, em seguida, repetindo até que todos os tecidos estejam completamente homogeneizados.
Alíquota de 10 microlitros de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição do teor de proteína, mantendo esses tubos também no gelo. Adicione 400 microlitros de tampão de extração gelado a cada amostra restante para um volume total de 500 microlitros e pipete para cima e para baixo suavemente para misturar.
Para cada reação, adicione 1 microlitro de lisado celular diluído a 150 microlitros da solução de reação recém-preparada. Misture bem pipetando suavemente, certificando-se de evitar a formação de bolhas. Em seguida, use um leitor de placas para medir a absorbância a 412 nanômetros a cada 10 a 30 segundos por quatro minutos a 25 graus Celsius.
Plote os dados como absorbância ao longo do tempo e, em seguida, calcule a inclinação para a parte linear da curva. Finalmente, divida a taxa de reação ou inclinação pela concentração de proteína da amostra para normalizar a atividade da citrato sintase.