Ensaio de proteção enzimática baseado em lisostafina: um método in vitro para quantificar a carga intracelular de Staphylococcus aureus por morte seletiva mediada por enzima de bactérias extracelulares

Comece com uma monocamada de células epiteliais em um meio de cultura adequado. Essas células expressam integrinas - receptores de superfície que atravessam a membrana. O meio de cultura contém fibronectina secretada por células epiteliais - uma glicoproteína.

Adicione uma suspensão de Staphylococcus aureus - uma bactéria patogênica gram-positiva - à placa de cultura. Essas bactérias contêm proteínas de ligação à fibronectina, ou FnBPs, ancoradas em sua parede celular.

Incube a placa para iniciar a infecção bacteriana, em que a fibronectina se liga ao FnBP da bactéria e às integrinas nas células hospedeiras epiteliais. Essa interação tripartida FnBP-fibronectina-integrina medeia a internalização bacteriana no hospedeiro.

Trate as células com lisostafina - uma enzima endopeptidase - e incuba. A lisostafina entra seletivamente nas paredes celulares das bactérias extracelulares. Ele cliva as pontes de pentaglicina nos peptidoglicanos, lisando-os enquanto as bactérias intracelulares permanecem protegidas da lisostafina.

Suplementar a cultura com uma enzima proteolítica para desativar a lisostapina restante, evitando que ela mate as bactérias intracelulares nas etapas.

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