Ensaio pull-down de molécula única para análise de fosforilação de proteínas: uma técnica de alto rendimento para quantificar a fosforilação de proteínas no lisado celular

A fosforilação de certas proteínas celulares é importante para sua função biológica.

Para quantificar os níveis de fosforilação de proteínas intactas usando um ensaio pull-down de molécula única, comece tomando uma lamínula de vidro com um padrão de matriz de grade. Cada compartimento é revestido com polietilenoglicol biotinilado ou ligantes à base de PEG intercalados com PEG normal para evitar impedimento estérico durante a ligação às proteínas.

Trate a lamínula com um reagente redutor para minimizar a autofluorescência na análise. Cubra a lamínula com Neutravidinas - proteínas de ligação à biotina - e incuba, permitindo que elas se liguem aos ligantes PEG biotinilados.

Complemente a matriz com anticorpos específicos contra proteínas-alvo. Cada anticorpo contém biotina ligada à sua região Fc, que ajuda a ancorar o anticorpo à neutravidina, causando imobilização.

Agora, adicione o lisado de cultura de células contendo várias proteínas, incluindo as variantes fosforiladas e não fosforiladas marcadas com fluorescência verde da proteína-alvo, e incuba. Ambas as variantes da proteína alvo são capturadas pelos anticorpos, formando complexos. Lave para remover as proteínas não ligadas.

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