Ensaio pull-down de molécula única para análise de fosforilação de proteínas: uma técnica de alto rendimento para quantificar a fosforilação de proteínas no lisado celular

A fosforilação de certas proteínas celulares é importante para sua função biológica.

Para quantificar os níveis de fosforilação de proteínas intactas usando um ensaio pull-down de molécula única, comece tomando uma lamínula de vidro com um padrão de matriz de grade. Cada compartimento é revestido com polietilenoglicol biotinilado ou ligantes à base de PEG intercalados com PEG normal para evitar impedimento estérico durante a ligação às proteínas.

Trate a lamínula com um reagente redutor para minimizar a autofluorescência na análise. Cubra a lamínula com Neutravidinas - proteínas de ligação à biotina - e incuba, permitindo que elas se liguem aos ligantes PEG biotinilados.

Complemente a matriz com anticorpos específicos contra proteínas-alvo. Cada anticorpo contém biotina ligada à sua região Fc, que ajuda a ancorar o anticorpo à neutravidina, causando imobilização.

Agora, adicione o lisado de cultura de células contendo várias proteínas, incluindo as variantes fosforiladas e não fosforiladas marcadas com fluorescência verde da proteína-alvo, e incuba. Ambas as variantes da proteína alvo são capturadas pelos anticorpos, formando complexos. Lave para remover as proteínas não ligadas.

Em seguida, trate esses complexos com o segundo conjunto de anticorpos marcados com fluorescência vermelha, que se ligam exclusivamente aos resíduos fosforilados da proteína, transmitindo um sinal de fluorescência diferente ao complexo.

Visualize a matriz sob um microscópio de fluorescência e observe dois sinais de fluorescência distintos. A colocalização de ambos os sinais de fluorescência indica a presença de proteínas fosforiladas na amostra.

Remova as matrizes funcionalizadas de biotina-PEG do freezer e equilibre-as à temperatura ambiente. Coloque a lamínula com a matriz voltada para cima sobre uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros forrada com filme de vedação. Incube cada quadrado da matriz com 10 miligramas por mililitro de borohidreto de sódio e PBS por 4 minutos em temperatura ambiente. Lave três vezes com PBS.

Em seguida, incube com 0,2 miligramas por mililitro de NeutrAvidina em T50 por 5 minutos, seguido de lavagem três vezes com T50-BSA. Repetir a incubação com 2 microgramas por mililitro de anticorpo biotinilado específico para POI em T50-BSA durante 10 minutos, seguido de lavagem.

Primeiro, descongele e misture o lisado pipetando. Dilua 1 microlitro do lisado em 100 microlitros de T50-BSA/PPI gelado. Incubar o lisado na matriz por 10 minutos, seguido de lavagem. Prepare o anticorpo antifosfotirosina conjugado com AF647 em T50-BSA/PPI gelado e incube na matriz por 1 hora.

Deposite uma gota de óleo na objetiva. Coloque a nanorrede no palco para a geração de imagens. Usando a luz branca transmitida, concentre-se no padrão de grade. Adquira uma série de 20 imagens da grade. Certifique-se de que os pixels não estejam saturados e salve a série de imagens como "Fiducial".

Desfoque a nanorrede para criar um padrão arejado. Adquira uma série de 20 imagens para calibrações de ganho e salve a imagem como "Ganho". Em seguida, adquira uma série de 20 imagens para deslocamento da câmera bloqueando toda a luz da câmera e salve a imagem como "Plano de fundo".

Para adquirir imagens SiMPull, primeiro limpe a objetiva de óleo e deposite óleo adicional na objetiva. Prenda a matriz de lamínula na platina do microscópio. Adquira imagens para cada amostra, primeiro no canal vermelho distante, seguido por fluoróforos de comprimento de onda mais baixo. Verifique o nível do buffer a cada 30 a 45 minutos e reabasteça conforme necessário.