Ensaio de oxidação de substrato em células cultivadas: um ensaio in vitro para quantificar a oxidação de substrato em células medindo sinais radioativos de CO₂ aprisionado

Em células metabolicamente ativas, os substratos contendo carbono são oxidados por meio de uma série de reações bioquímicas para gerar energia e liberar dióxido de carbono como subproduto.

Para determinar a taxa de oxidação do substrato, comece com uma cultura aderente das células indiferenciadas desejadas. Suplementar as células num meio com um substrato adequado contendo carbono radioactivo catorze na sua estrutura e incubar.

As células consomem o substrato e o oxidam para liberar dióxido de carbono radiomarcado, que se difunde das células para o meio circundante.

Transfira este meio para um conjunto de retenção de gás contendo ácido perclórico para extinguir a reação. Este tubo contém um papel de filtro embebido em hidróxido de sódio instalado dentro da tampa do tubo. Feche a tampa e incuba.

Durante a incubação, o dióxido de carbono, em sua forma gasosa, é liberado dentro do tubo. O hidróxido de sódio absorve o dióxido de carbono radiomarcado, prendendo-o no papel de filtro. Transfira este papel de filtro para um frasco contendo um coquetel de cintilação e posicione-o dentro do balcão de cintilação líquida.

Dentro do balcão, o carbono radiomarcado sofre decaimento radioativo, emitindo partículas beta de alta energia. Essas partículas são absorvidas pelos componentes do coquetel de cintilação e emitem pulsos de luz, que são calculados pelo contador de cintilação.

A quantidade de radioatividade detectada se correlaciona com a taxa de oxidação do substrato nas células.

Lave as células nos poços extras, duas vezes com DPBS. Dissocie as células com 0,25% de tripsina-EDTA. Ressuspenda 20 microlitros de células digeridas em DPBS com 20 microlitros de solução de corante de laranja de acridina e iodeto de propídio. Determine o número de células ativas com um contador de células automatizado e registre o número.

Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com DPBS. Adicione 500 microlitros de meio quente a cada poço de ensaio na capa de cultura de tecidos designada pela RAM. Depois de selar a placa com parafilme, incube as células em uma incubadora designada para RAM a 37 graus Celsius por quatro horas.

Durante a incubação, corte o papel de filtro em pedaços circulares ligeiramente maiores do que a área dentro da tampa do tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e insira o papel confortavelmente na tampa. Adicione 200 microlitros de ácido perclórico 1 molar a cada tubo e 20 microlitros de hidróxido de sódio ao papel de filtro encaixado dentro da tampa.

Depois de incubar as células, transfira 400 microlitros de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubos em temperatura ambiente por 1 hora.

Paralelamente, durante a incubação, configure um frasco de cintilação para cada tubo e encha-o com 4 mililitros de fluido de cintilação. Transfira cada pedaço de papel de filtro para um frasco de cintilação e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Realize testes de limpeza na capa de cultura de tecidos, no banho-maria, na geladeira, na incubadora, na pia, no solo e em qualquer outra área de trabalho para verificar se há possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.

Meça a radioatividade do carbono-14 nos frascos de cintilação com um contador de cintilação e registre os resultados da leitura. Descontamine o ambiente de trabalho de acordo com as diretrizes de segurança contra radiação, se necessário.