Ensaio de Separação de Fase de Proteína: Um Método Optogenético para Separação de Fase de Proteína de Ligação a RNA Mutante em Neurônios Motores Espinhais de Larvas de Peixe-Zebra

As proteínas de ligação ao RNA nuclear, RBPs, são proteínas multifuncionais compostas por regiões ordenadas com estrutura tridimensional bem definida e regiões menos estáveis e intrinsecamente desordenadas, IDRs.

Em várias doenças neurodegenerativas, as mutações específicas do IDR fazem com que os RBPs se localizem incorretamente no citoplasma e se envolvam aberrantemente em interações fracas, formando inclusões dinâmicas e sem membrana - um fenômeno chamado separação de fases. Eventualmente, essas inclusões amadurecem em agregados tóxicos e insolúveis, resultando em disfunção neuronal e degeneração.

Para investigar a separação de fases RBP in vivo usando optogenética, comece com uma larva de peixe-zebra transgênica anestesiada e descorionada, expressando uma RBP com mutação IDR fundida a um repórter fluorescente e um domínio fotorreceptor sensível à luz azul, em tampão adequado.

Em seguida, monte a larva lateralmente em uma gota de agarose derretida para imagens da medula espinhal. Deixe a agarose solidificar, imobilizando a larva. Usando um microscópio confocal, adquira imagens da medula espinhal para visualizar os RBPs fluorescentes, localizados dentro dos núcleos neuronais.

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