Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:57 min. • July 8th, 2025
Durante a regeneração óssea, os osteoblastos - células formadoras de osso - são recrutados para o local fraturado, onde proliferam e secretam osteóide - uma matriz colágena. Após um período de maturação, os osteoblastos mineralizam o osteóide por deposição regulada de íons cálcio e fosfato, iniciando a nova síntese óssea.
Para quantificar o grau de mineralização dos osteoblastos in vitro, obter a suspensão primária de osteoblastos em meios adequados. Semeie a suspensão em uma placa de vários poços contendo discos substitutos de enxerto ósseo poroso e incuba.
Os discos servem como um andaime, permitindo a adesão e proliferação celular.
Substitua os meios gastos por meios novos contendo suplementos osteogênicos. Incubar por um período prolongado. Os suplementos osteogênicos estimulam os osteoblastos a produzir e posteriormente mineralizar a matriz colágena.
Após a fixação, corar a matriz mineralizada com solução de vermelho de alizarina S, ARS. ARS, um corante carregado negativamente, liga-se a íons de cálcio carregados positivamente na matriz, formando um complexo de cor vermelha. Remova o excesso de manchas. Imagem da placa para detectar depósitos de cálcio vermelho, sugestivos de mineralização de osteoblastos.
Em seguida, adicione cloreto de cetilpiridínio, CPC, solução. O CPC, um surfactante carregado positivamente, na forma micelar, complexa através de seus grupos principais com ARS de carga oposta ligado a íons de cálcio na matriz, facilitando a extração do corante na solução.
Recolha e centrifugue a solução. Transfira o sobrenadante contendo complexos de corante CPC para uma placa de vários poços e meça a absorbância usando um leitor de microplacas.
A absorbância dos complexos de corante CPC indica a quantidade de depósitos de cálcio na matriz, uma estimativa do grau de mineralização dos osteoblastos.
Transfira os discos de fosfato beta-tricálcico corados para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de mesa para registrar a mineralização.
Após a captura da imagem, adicione 250 microlitros de solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% e agite por 15 minutos para extrair o corante vermelho de alizarina S. Em seguida, transfira a solução dos poços para tubos individuais de 1,5 mililitro e centrifugue a 17.000 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente.
Diluir o extracto com solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% numa proporção de diluição de 1:10 a 1:20 num tubo de 1,5 mililitros. Em seguida, transfira 300 microlitros de cada amostra diluída para os poços da placa de 96 poços. Incluir dois alvéolos em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilpiridínio.
Em seguida, prepare sete padrões de referência de vermelho de alizarina S variando de 4 a 400 micromolares, diluindo 40 milimolares de solução de coloração de vermelho de alizarina S com solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% para gerar uma curva padrão.
Carregue 300 microlitros de cada padrão na placa. Por fim, leia a absorbância das amostras, brancos e padrões de referência em 520 nanômetros.