JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:08 min • July 8th, 2025
A angiogênese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos sanguíneos existentes durante condições patológicas e de desenvolvimento. A comunicação extensa entre as células endoteliais que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos e os pericitos circundantes - células de suporte no lado externo dos vasos sanguíneos - é crucial para a angiogênese.
Para estudar a angiogênese in vitro, comece com células endoteliais e esferas microcarreadoras revestidas com pericitos suspensas em uma solução de fibrinogênio - uma glicoproteína solúvel que atua como um precursor da fibrina.
Agora, pipete a suspensão do grânulo em uma placa de cultura contendo uma solução de trombina - uma enzima proteolítica - e incuba. A trombina se liga à molécula de fibrinogênio, fazendo com que sua clivagem forme monômeros de fibrina insolúveis, formando gel de fibrina polimérica. Esta etapa garante a incorporação de grânulos revestidos de células no gel de fibrina.
Em seguida, coloque uma cultura de fibroblastos - células precursoras do tecido conjuntivo - em cima do gel de fibrina e incube para permitir a ativação dos fibroblastos.
Durante a incubação, os fibroblastos secretam fatores de crescimento angiogênicos cruciais que desencadeiam a ativação das células endoteliais. Em combinação, pericitos aderentes e células endoteliais secretam moléculas sinalizadoras que ajudam no brotamento de células endoteliais no gel de fibrina.
Os brotos endoteliais aparecem como saliências celulares alongadas envoltas em pericitos, representando o estágio inicial da angiogênese.
Examine os pratos de esferas revestidas com microportadores ao microscópio com ampliação de 20 vezes para confirmar que todas as esferas foram suficientemente revestidas pelas células endoteliais.
Transfira as placas para uma capela de fluxo laminar e use uma pipeta P1000 para aspirar e dispensar vigorosamente as soluções de esferas revestidas para separar as células do fundo da placa e transferir os sobrenadantes para tubos individuais.
Deixe as contas assentarem no fundo dos tubos por três minutos. Em seguida, use a pipeta P1000 para remover o máximo possível dos sobrenadantes sem perturbar os aglomerados de contas. Ressuspenda as contas em um mililitro de meio completo por tubo e deixe as contas assentarem por 30 a 60 segundos. Use a pipeta P1000 para aspirar o sobrenadante novamente e lave as células endoteliais flutuantes da suspensão do grânulo com meio completo fresco, mais duas vezes, como acabamos de demonstrar.
Após a terceira lavagem, ressuspenda as esferas em 2,5 mililitros de solução de fibrinogênio. Adicione 13 microlitros de solução de trombina por poço, em uma placa de fundo de vidro de 24 poços. Em seguida, adicione 0,5 mililitros da solução de grânulo / fibrinogênio a cada poço, tomando cuidado para pipetar cuidadosamente os grânulos diretamente na trombina e pipetar lentamente para cima e para baixo duas a três vezes para misturar bem as soluções.
Quando todos os poços tiverem sido semeados, deixe a solução de trombina-fibrinogênio pré-coagular na capela de fluxo laminar por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius por mais 1,5 a 2 horas.
Quando o gel estiver totalmente solidificado, ressuspenda os fibroblastos pulmonares humanos normais na concentração de 2 x 104 células por mililitro em meio completo e adicione um mililitro de fibroblastos a cada poço. Em seguida, retorne a placa para a incubadora de cultura de células.