Ensaio de contato larval: um procedimento para avaliar a mortalidade larval de mosquito após contato direto com o composto larvicida de teste

Para avaliar o potencial de um composto larvicida de teste, um antagonista do receptor de dopamina, usando o ensaio de contato larval, comece com larvas de mosquitos vivos em seu estágio de desenvolvimento ou ínstar desejado em meio aquoso. Transfira um número igual de larvas para os poços de uma placa de vários poços.

Substitua o meio nos poços por água deionizada para evitar qualquer interferência de contaminantes que possam impactar negativamente as larvas. Adicionar concentrações crescentes do composto de teste aos respectivos poços.

Gire suavemente a placa para facilitar o contato entre as larvas e o composto de teste. Incubar a placa em condições adequadas.

Ao entrar em contato com as larvas, o composto de teste entra na parede do corpo ou na camada mais externa e atinge os espiráculos, aberturas do sistema traqueal, que estão conectados aos gânglios - aglomerado de células nervosas - que compreendem o sistema nervoso central.

Nas células nervosas, o composto de teste se liga aos locais de ligação secundários dos receptores de dopamina, que estão envolvidos em processos celulares críticos. Essa ligação, mesmo com o neurotransmissor dopamina ligado ao receptor de dopamina, impede a ativação do receptor e a sinalização a jusante, interrompendo o desenvolvimento larval, causando a morte.

Registar o número de larvas não responsivas, sem movimento, em cada alvéolo num determinado momento após a exposição ao composto de ensaio em diferentes concentrações de compostos.

O aumento da taxa de mortalidade larval com o aumento da concentração indica o potencial larvicida do composto de teste.

Para começar, rotule os poços de uma placa de cultura de tecidos transparente de 24 poços. Utilizar uma balança analítica para pesar a substância de ensaio. Em seguida, dissolva o composto em água estéril e bidestilada em um tubo de 1,5 mililitro, resultando em uma solução estoque de 80 milimolares. Em seguida, diluir em série a solução de estoque usando água bidestilada para preparar soluções de estoque de trabalho nas concentrações desejadas.

Note-se que há que ter cuidado quando as larvas são adicionadas aos poços, durante a remoção do excesso de água e quando é adicionada a química de ensaio, para evitar danos físicos nas larvas. A lesão pode aumentar a mortalidade e, portanto, produzir resultados falsos positivos ou invalidar o ensaio.

Use uma pipeta de transferência de plástico de diâmetro largo para transferir cinco larvas de terceiro ínstar para cada poço da placa. Em seguida, use uma pipeta de 1 mililitro para remover suavemente a água e substitua-a pelo volume desejado de água bidestilada

Tome cuidado para não tocar nas larvas ao remover a água. Trabalhe rapidamente para garantir que as larvas não sequem e adicione suavemente a química de teste pipetando contra o lado oposto do poço de plástico.

Adicione um volume apropriado de solução de teste a cada poço e gire suavemente a placa para garantir uma mistura uniforme. Coloque a placa em uma câmara de crescimento, mantendo o ciclo claro-escuro de 12 horas a 25 graus Celsius com 75% a 85% de umidade relativa.

Para verificar o movimento larval, bata suavemente na placa. Se nenhum movimento for observado, toque suavemente a larva com um palito estéril. Classifique a larva como morta se nenhuma resposta for observada e use uma folha de pontuação para registrar o número total de larvas mortas em cada poço nos pontos de tempo descritos no protocolo de texto.