Ensaio de teste tópico: uma técnica para avaliar o potencial inseticida de antagonistas do receptor de dopamina em mosquitos fêmeas adultas por aplicação tópica

O ensaio de teste tópico em mosquitos depende da deposição direta de um composto de teste ativo no tórax dorsal de mosquitos adultos para testar sua propriedade inseticida.

Para começar, anestesiar mosquitos fêmeas adultas, expondo-os ao mínimo térmico crítico - uma temperatura baixa que cessa sua atividade neuromuscular.

Coloque os mosquitos fêmeas anestesiados individualmente sob um microscópio de dissecação. Pegue uma seringa de vidro conectada ao microaplicador cheia com o composto de teste - um antagonista do receptor de dopamina - em um solvente apolar. Posicione a agulha perto do tórax e use o microaplicador para depositar cuidadosamente uma gota do composto de teste na superfície dorsal.

Após a aplicação, transferir os mosquitos tratados para uma câmara de crescimento com condições ambientais controladas por um determinado período.

O solvente apolar na gotícula solubiliza lipídios na cutícula - uma cobertura externa - permitindo que o composto penetre no interior. O composto se difunde através da camada epidérmica abaixo e atinge os gânglios torácicos - um grupo denso de células nervosas conectadas ao sistema nervoso.

Ao atingir as células nervosas, o composto se liga a um local alostérico - um local de ligação adicional para moléculas reguladoras - no receptor de dopamina. A ligação alostérica dificulta a cascata de sinalização a jusante ao se ligar à dopamina - um neurotransmissor que controla processos biológicos críticos - levando à morte.

Após a duração do experimento, registre o número de mosquitos mortos - indivíduos tratados sem qualquer movimento - para avaliar o potencial inseticida do composto de teste.

Cultura de mosquitos fêmeas adultas de 3 a 5 dias em uma gaiola de plástico de 20 litros. Rotule os copos de papel de 9 onças com o nome e a concentração do composto de teste.

Em seguida, preparar uma solução-mãe de 10 μg/μL do composto de ensaio em acetona num frasco de vidro de 20 mililitros. Em seguida, dilua em série a solução de estoque para obter as concentrações de trabalho desejadas.

Limpe uma seringa de vidro de 1 mililitro com acetona e, em seguida, encha-a com a solução de teste na concentração apropriada. Fixe a seringa em um microaplicador, ajustado para fornecer um volume de 0,25 microlitros.

Em seguida, use um aspirador para remover dez mosquitos fêmeas adultas de 3 a 5 dias da gaiola e anestesiá-los por 5 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, transfira os mosquitos para uma placa de Petri e coloque o prato no gelo por 10 minutos.

Para evitar danos ao mosquito adulto, o que pode contribuir para a mortalidade, certifique-se de que eles não sejam anestesiados na geladeira por mais de 5 minutos, ou imobilizados no gelo por mais de 10, e minimize o manuseio dos mosquitos. Se você tiver acesso a uma placa fria e um micromanipulador com um estágio móvel, isso pode minimizar ainda mais o manuseio dos mosquitos.

Use uma pinça fina para remover cada mosquito do prato. Com o microaplicador de seringa, aplique 0,25 microlitros de solução de teste no tórax dorsal sob um microscópio de dissecação. Em seguida, transfira os mosquitos para um copo de papel rotulado com gelo. Sele o copo com um quadrado de malha de 10 por 10 centímetros e um elástico. Em seguida, transfira-o para a câmara de crescimento e registre o número de mosquitos mortos.