JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:38 min • July 8th, 2025
A endotoxina, uma toxina bacteriana gram-negativa presente na membrana externa, é um lipopolissacarídeo, LPS, composto principalmente por lipídios e polissacarídeos, incluindo lipídios A e antígeno O. Quando liberado durante a infecção, é reconhecido pelo sistema imunológico, desencadeando respostas inflamatórias baseadas em citocinas.
Para estimar a contaminação por endotoxinas em uma nanoformulação de medicamento lipossomal usando o lisado de amebócitos Limulus, LAL, ensaio, prepare tubos de reação, um contendo o medicamento e outro contendo o medicamento enriquecido com uma concentração de endotoxina conhecida.
Adicione o reagente LAL contendo lisado de proteína obtido de caranguejo-ferradura, Limulus polyphemus, células sanguíneas ou amebócitos. O lisado inclui serina proteases inativas - fator B, fator C, enzima proclotante - e uma proteína coagulante em gel, coagulogênica.
Vortex os tubos e carregue-os em um turbidímetro para medir a turbidez das soluções.
Na presença de LPS contaminante ligado a drogas lipossomais, o fator C sensível ao LPS é ativado autocataliticamente, que então cliva e ativa o fator B que converte a enzima pró-coagulação em enzima de coagulação. Esta enzima ativada cliva as ligações peptídicas coagulogênicas, formando monômeros de coagulina.
Eventualmente, os monômeros polimerizam por meio de interações entre as regiões hidrofóbicas expostas na cabeça de um e a cauda hidrofóbica de outro, levando à agregação e formação de gel de coagulina turvo insolúvel. A turbidez medida ajuda a determinar a concentração de endotoxina na nanoformulação.
A recuperação de pico calculada das concentrações de endotoxina nas amostras enriquecidas e de teste dentro da faixa aceitável indica que não há grande interferência da nanoformulação, validando a presença de endotoxinas no medicamento nanoformulado.
Para a preparação do padrão de calibração, use 900 microlitros de lisado de amebócitos Limulus ou água de grau LAL e 100 microlitros de endotoxina padrão de controle, para preparar quantas diluições intermediárias forem necessárias, para permitir a preparação de um padrão de calibração com uma concentração de uma unidade de endotoxina por mililitro.
Em seguida, usando 900 microlitros de água de grau LAL e 100 microlitros do padrão de calibração de uma unidade de endotoxina por mililitro, prepare um segundo padrão de calibração a uma concentração de 0,1 unidade de endotoxina por mililitro.
Em seguida, repita a diluição serial de 10 vezes para preparar dois padrões de calibração inferiores, para obter um total de quatro padrões de calibração variando de 0,001 a 1 unidade de endotoxina por mililitro.
Para preparar um controle de qualidade de 0,05 unidade de endotoxina por mililitro, combine 50 microlitros de uma unidade de endotoxina por mililitro de solução de endotoxina padrão de controle com 950 microlitros de água de grau LAL.
Em seguida, no software, selecione 'Configurações do instrumento' e crie o modelo. Selecione 'Coletar dados' e insira o ID de teste e o grupo de dados na guia 'Geral'. Na guia 'Hardware', selecione o tipo de instrumento e o método LAL e verifique se um número de série, o ID do sistema e as informações da porta serial aparecem na tela.
Clique em 'OK' duas vezes para confirmar a seleção do instrumento e a comunicação com o instrumento e insira os IDs de amostra na mesma ordem em que as amostras serão testadas. Em seguida, use os botões padrão para inserir o controle negativo, a curva padrão e as amostras de teste.
Adicione o volume apropriado de padrões de calibração de controle negativo e controle de qualidade em tubos de vidro pré-rotulados duplicados e adicione o volume apropriado de LAL ao primeiro frasco de teste. Vortex o frasco brevemente e coloque o frasco nas ranhuras de teste apropriadas no carrossel de instrumentos.
Antes de carregar as amostras, efectuar várias diluições do nanomaterial de ensaio dentro da diluição máxima válida, tal como demonstrado.