Ensaio de triagem enzimática à base de hidrogel de polímero cromogênico: um método de alto rendimento para rastrear as enzimas ativas em carboidratos usando substratos sintéticos

As enzimas degradadoras de carboidratos decompõem os polissacarídeos complexos em oligossacarídeos menores.

Para rastrear a atividade de degradação da enzima, comece tomando vários hidrogéis de polímero cromogênico, CPH, que são preparados tingindo polissacarídeos com corantes de clorotriazina de cores diferentes. Cada polissacarídeo é então quimicamente reticulado para formar hidrogel - um substrato sintético para a degradação enzimática.

Agora, dispense diferentes substratos de CPH em poços distintos de uma placa de reação porosa. Adicione uma solução de ativação e incube-a para garantir a ativação ideal dos substratos.

Coloque a placa de ensaio sobre uma placa de produto vazia. Centrifugue as placas juntas a uma velocidade baixa para facilitar a remoção eficiente da solução de ativação através dos poros da placa de reação.

Em seguida, suplemente todos os poços da placa de reação com o mesmo tipo de enzima degradadora de carboidratos em um tampão apropriado que mantenha um pH ideal para a atividade enzimática. Sele a placa e incube-a com agitação suave para permitir uma distribuição uniforme das enzimas na rede polimérica, permitindo que elas acessem o substrato.

Durante a incubação, a enzima, com atividade apropriada contra o substrato, degrada os polissacarídeos no CPH para produzir oligossacarídeos ligados a corantes menores. Esses produtos são solúveis, tornando a solução colorida. Gire as placas para coletar a solução colorida na placa do produto.

Espectrofotometricamente, determine a absorbância do produto para medir a atividade enzimática.

Para começar, ative a placa do kit de ensaio de filtro de 96 poços adicionando 200 microlitros de solução de ativação a cada poço. Incube em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos.

Use uma centrífuga e qualquer placa padrão de 96 poços para coleta para reduzir a solução de ativação existente. Adicione 100 microlitros de água estéril ao Polímero Cromogênico Hidrogel, ou substratos CPH, e aplique um vácuo ou centrifugação para remover o estabilizador. Repita a lavagem mais duas vezes.

Para preparar a reação enzimática, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 milimolares pH 4,5 e 5 microlitros de solução de endocelulase com três concentrações diferentes a cada poço da placa do kit de ensaio.

Coloque a placa do produto embaixo da placa do kit de ensaio para coletar qualquer vazamento potencial da placa de reação durante a agitação. Em seguida, incubar a placa do kit de ensaio à temperatura ambiente num agitador horizontal a 100 RPM durante 30 minutos.

Para receber dados confiáveis, é necessário agitar a mistura de reação durante a incubação.

Coloque a placa do kit de ensaio com a placa do produto embaixo dela na centrífuga e gire a 2.700 x g por 10 minutos, para transferir o produto da reação para os poços da placa do produto.

Após a centrifugação, inspecione visualmente a placa do produto para verificar se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo. Usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta a 630 nanômetros para os diferentes substratos verdes de CPH.