JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:31 min • July 8th, 2025
Os mitocanos são uma classe de medicamentos que afetam seletivamente o funcionamento das mitocôndrias nas células cancerígenas e induzem a apoptose.
Para determinar a citotoxicidade mitocana, semeie uma suspensão celular contendo células cancerígenas semi-aderentes em uma placa de vários poços. Trate a placa com a solução mitocan desejada e incuba.
O mitocano entra na célula cancerosa para interromper sua atividade mitocondrial, levando à morte celular em células cancerígenas sensíveis ao mitocano. Tratar as células com uma solução de coloração contendo uma mistura de corante Hoechst e iodeto de propídio.
Hoechst, um corante fluorescente permeável à membrana, penetra em todas as células e se liga à região rica em AT de seu DNA, conferindo uma fluorescência azul aos núcleos de células vivas e mortas.
Em contraste, o iodeto de propídio, um corante fluorescente impermeável à membrana, entra exclusivamente nas células mortas através das porções danificadas de suas membranas. O corante se intercala entre as bases do DNA, conferindo uma fluorescência vermelha adicional às células mortas. A presença de ambos os corantes nos núcleos dessas células faz com que as células mortas pareçam roxas.
Centrifugue a placa em baixa velocidade para assentar as células para maior precisão durante a imagem. Imagem sob um microscópio de fluorescência e observe duas populações de células distintas. Conte o número de ambos os tipos de células.
A porcentagem de glóbulos roxos que representam a população morta em comparação com a população total indica o potencial citotóxico do mitocan de teste.
Comece preparando soluções dos compostos de interesse na concentração desejada. Certifique-se sempre de misturar os compostos por vórtice completamente.
Para medir a citotoxicidade de um único composto, prepare compostos em concentração final 2X. Se medir a citotoxicidade de combinações de compostos, prepare-as em uma concentração final de 4X.
Prepare os controles somente de solvente misturando a mesma quantidade de solvente com o meio apropriado. Colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros e alíquota de 10 microlitros da suspensão celular para coloração com azul de tripano. Adicione 10 microlitros de azul de tripano a 0,4% à alíquota e use um hemocitômetro ou contador de células para contar as células viáveis e não viáveis.
Células de pellets no tubo de 15 mililitros a 200 x g por 5 minutos e, em seguida, aspirar ou decantar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em meio apropriado para o ensaio a uma densidade celular de 3x105 células por mililitro. Use uma pipeta multicanal para semear 50 microlitros de suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços.
Para ensaios de composto único, adicione 50 microlitros de solução composta 2X em cada poço. Para poços de controle de solvente, adicione 50 microlitros de meio de teste contendo o solvente na concentração 2X. Para ensaios combinados, adicione 25 microlitros de cada um dos compostos 4X em cada poço. Para poços de controle de composto único, adicione 25 microlitros de solução composta 4X e meio de teste. Certifique-se de que a concentração final de DMSO não exceda 0,5%.
Para garantir a reprodutibilidade, adicione os fármacos com a ponta da pipeta tocando a lateral dos poços, tendo o cuidado de adicionar os fármacos em locais diferentes. Esta etapa deve ser realizada muito rapidamente, de preferência não levando mais de 30 minutos por placa.
Bata suavemente na placa para misturar o conteúdo dos poços e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Quando estiver pronto para corar as células com Hoechst 33342 e iodeto de propídio, prepare uma nova solução de coloração 10X e adicione 10 microlitros a cada poço. Bata suavemente na placa e incube-a a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Centrifugue a placa a 200 x g por 4 minutos para trazer todas as células para o fundo da placa. Em seguida, limpe cuidadosamente o fundo da placa com um pano úmido de laboratório para remover quaisquer detritos que possam interferir na imagem. Imagem da placa dentro de 15 minutos após a centrifugação.