Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

Durante certas condições patológicas, os eritrócitos ou glóbulos vermelhos sofrem encolhimento celular acompanhado pela translocação do fosfolipídio da membrana - fosfatidilserina - do folheto da membrana interna para a externa, levando à morte celular programada, eriptose, desencadeando fagocitose celular mediada por macrófagos.

Para medir a eriptose induzida por ionóforo em população isolada de eritrócitos humanos por meio do ensaio de ligação da Anexina V, comece com eritrócitos suspensos em um tampão livre de glicose.

A depleção de glicose induz estresse celular, ativando a proteína quinase C citosólica, que subsequentemente ativa os canais de cálcio e causa o influxo de íons cálcio. Além disso, os canais de potássio são ativados, causando efluxo de potássio e encolhimento celular.

Em seguida, adicione ionóforo de cálcio que forma um complexo estável com íons de cálcio extracelulares. O complexo facilita a entrada citosólica de íons de cálcio através da membrana celular, aumentando ainda mais a concentração intracelular de cálcio. Isso, por sua vez, ativa o scramblase - um transportador bidirecional de fosfolipídios - que auxilia na translocação da fosfatidilserina do folheto da membrana celular interna para a externa, reduzindo a assimetria da membrana e induzindo a eriptose.

Centrifugue os eritrócitos tratados com ionóforo. Ressuspenda as células em um tampão de ligação contendo cálcio. Adicione a solução de Anexina V conjugada com corante fluorescente.

A proteína de ligação a fosfolipídios dependente de cálcio, Anexina V, com alta afinidade por fosfatidilserina, liga-se aos resíduos de fosfatidilserina expostos no folheto da membrana celular externa.

Usando a classificação de células ativadas por fluorescência, separe a população de eritrócitos com base na intensidade de fluorescência da anexina V. Os eritrócitos eripóticos exibem maior intensidade de fluorescência da Anexina V do que os eritrócitos saudáveis.

Dilua 2 mililitros do tampão de ligação 5X Anexina V em 8 mililitros de PBS para obter o tampão de ligação 1X. Ressuspenda os grânulos de células tratadas com ionomicina e não tratadas em 1 mililitro do tampão de ligação 1X.

Pegue 235 microlitros das suspensões celulares no tampão de ligação e adicione 15 microlitros de conjugado Anexina V-Alexa Fluor 488 em um tubo de microcentrífuga. Incube as células em temperatura ambiente por 20 minutos em local escuro.

Centrifugue a 700 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante. Lave as células duas vezes com tampão de ligação 1X, suspendendo o pellet celular em 1,5 mililitros do tampão de ligação e centrifugando a 700 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.

Remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 250 microlitros de tampão de ligação 1X para medições de citometria de fluxo. Agora, transfira 200 microlitros de eritrócitos corados com anexina V para tubos de poliestireno de fundo redondo de 1 mililitro compatíveis com citometria de fluxo.

Faça login no software de citometria de fluxo e clique no botão 'Novo experimento'. Clique no botão 'Novo tubo', selecione a 'Folha Global' e escolha 'Aplicar análise' para medir a intensidade de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros.

Defina o número de células para 20.000 a serem coletadas para análise de classificação de células ativadas por fluorescência. Selecione o tubo desejado e clique no botão 'Carregar'. Clique no botão 'Gravar' para medições de dispersão direta e lateral. Repita para todas as amostras.

Clique com o botão direito do mouse no botão 'Amostra' e clique em 'Aplicar análise em lote' para gerar o arquivo de resultados. Clique com o botão direito do mouse no botão 'Espécime' e clique em 'Gerar arquivos FSC'.