Ensaio de depleção de glicose in vitro: um método baseado em fluorescência para quantificar a captação de glicose celular por meio da medição da depleção de glicose extracelular

A glicose, uma fonte primária de energia celular, entra nas células por meio de proteínas transportadoras de glicose da membrana celular. A glicose é decomposta no citoplasma da célula em piruvato, através da via glicolítica, gerando energia através do trifosfato de adenosina, ou ATP, para o metabolismo celular.

Para medir a captação intracelular de glicose, comece com uma cultura aderente de fibroblastos em uma placa de vários poços. Substitua o meio por meio sem glicose e incuba. As células metabolizam a glicose disponível para produzir energia, atingindo um estado de falta de glicose.

Substitua o meio em um conjunto de poços por meios sem glicose contendo insulina, um estimulador de captação de glicose e desoxiglicose fluorescente, um análogo da glicose. Trate outro conjunto de poços com meios livres de glicose contendo desoxiglicose fluorescente.

Durante a incubação, a insulina estimula a translocação de transportadores adicionais de glicose para a membrana plasmática, facilitando o aumento da captação de desoxiglicose fluorescente, na ausência de glicose.

A desoxiglicose é fosforilada e não metabolizada pelas células. Ao mesmo tempo, a concentração extracelular de desoxiglicose fluorescente diminui.

Após a incubação, colete o meio contendo desoxiglicose fluorescente não utilizada. Trate as células com um tampão de lise. O detergente no tampão forma micelas e solubiliza as membranas celulares, causando liberação de conteúdo intracelular.

Usando um leitor de microplacas, meça a fluorescência do homogeneizado celular contendo desoxiglicose fluorescente intracelular e meios contendo desoxiglicose fluorescente extracelular não utilizada.

Os fibroblastos estimulados por insulina exibem aumento da captação de desoxiglicose fluorescente intracelular e diminuição correspondente da desoxiglicose fluorescente extracelular em comparação com células não estimuladas.

Use 8 réplicas para cada condição de simulação. Portanto, prepare 1 mililitro para cada condição de simulação.

Use 7 condições de simulação sem insulina: FD-glicose de 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 micrograma por mililitro e 0 miligrama por mililitro em uma placa de 96 poços.

Use 7 condições de estimulação com insulina: FD-glicose de 2.5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0.5 micrograma por mililitro, 0.2 micrograma por mililitro, 0.1 micrograma por mililitro, 0.05 micrograma por mililitro e 0 micrograma por mililitro em outra placa de 96 poços.

Para preparar as condições de estimulação, diluir 1 microlitro de 5 miligramas por mililitro de solução de trabalho FD-glicose e 999 microlitros de DMEM livre de glicose para obter 1 mililitro de solução de estoque de trabalho.

Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare diluições 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 e 1:100.000 de FD-glicose para obter 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 micrograma por mililitro em tubos de 2 mililitros imediatamente antes dos experimentos em um gabinete de biossegurança sem luzes. Adicione 1 microlitro de insulina a cada uma dessas condições.

Após 40 minutos de incubação, decantar o DMEM isento de glicose de cada poço em placas de 96 poços e absorver o fluido restante com papel toalha estéril. Adicione 100 microlitros cada uma das várias condições de tratamento descritas anteriormente, aos poços ao longo de uma coluna, e 100 microlitros da mesma condição de tratamento aos poços ao longo da linha em ambas as placas de 96 poços. Rotule as placas que utilizaram as condições com e sem insulina.

Adicione DMEM livre de glicose sozinho aos alvéolos de controle. Incubar a placa durante 40 minutos numa incubadora de cultura de células no escuro.

Após as células terem sido estimuladas por 40 minutos, transfira os meios de estimulação de ambas as placas para novas placas de 96 poços, mantendo o mesmo layout experimental. Lave as células com PBS. Remova o PBS e transvase qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis.

Adicione um inibidor de protease ao tampão de ensaio de radioimunoprecipitação para proteger as proteínas. Coloque as placas contendo o ensaio de radioimunoprecipitação em um agitador por 30 minutos.

Usando um leitor de microplacas, medir a fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nanômetros, respectivamente, primeiro, no meio contendo FD-glicose extracelular e, em seguida, a placa com células lisadas por ensaio de radioimunoprecipitação no final de 30 minutos de incubação.