Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:04 min. • July 8th, 2025
Nos tecidos, a glicose extracelular entra nas células por meio de difusão facilitada por meio de transportadores específicos de glicose.
A glicose é decomposta em piruvato no citoplasma celular por meio da glicólise, uma via metabólica, gerando energia na forma de trifosfato de adenosina, ou ATP, para processos metabólicos celulares.
Para medir a captação de glicose ex vivo, comece com tecido hepático de camundongo de tamanho pequeno recém-colhido. Adicione tampão adequado para manter as condições fisiológicas.
Em seguida, transfira o tecido para uma placa de vários poços contendo meios livres de glicose. Em seguida, incubação em meio livre de glicose suplementado com desoxiglicose, um análogo de glicose marcado com fluorescência. O pequeno tamanho do tecido permite a entrada de desoxiglicose.
A desoxiglicose entra nas células através de transportadores de glicose, na ausência de glicose. Dentro das células, a desoxiglicose sofre fosforilação, mas não é metabolizada mais, levando ao seu acúmulo.
Colete a mídia contendo desoxiglicose marcada com fluorescência não utilizada nos pontos de tempo desejados. Usando um leitor de microplacas, meça a fluorescência da desoxiglicose extracelular, que pode ser correlacionada com a captação intracelular de desoxiglicose no tecido.
Incube os tecidos ou órgãos colhidos em uma placa de 6 poços contendo PBS por um minuto. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado. Após um minuto, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver o PBS.
Transfira tecidos ou órgãos em uma placa separada de 6 poços contendo 4.000 microlitros de DMEM livre de glicose e incube por dois minutos. Após dois minutos, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de 6 poços contendo 0,29 solução de trabalho de FD-glicose milimolar. Incube as placas de 6 poços contendo tecidos em solução de trabalho de FD-glicose a 37 graus Celsius.
Colete 100 microlitros de solução de trabalho de FD-glicose de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos de incubação e transfira 100 microlitros coletados de solução de trabalho de FD-glicose em placas de 96 poços para analisar a cinética de depleção extracelular de FD-glicose. Agite antes e depois da coleta.
Meça a fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nanômetros, respectivamente, usando um leitor de microplacas.