Medindo a contração do SMC in vitro: um método não invasivo para avaliar a contração das células musculares lisas usando detecção de impedância de substrato de célula elétrica

A parede da aorta possui predominantemente células musculares lisas, ou SMCs, contendo maquinário de proteínas contráteis que se contraem e relaxam para regular o fluxo sanguíneo aórtico.

Para medir a resposta contrátil de SMCs aórticos in vitro, obtenha uma placa de vários poços contendo uma matriz de sensores de detecção de impedância de substrato de célula elétrica, ou ECIS. Cada matriz contém eletrodos de filme de ouro no fundo do poço, delineados com um filme isolante. Cubra os poços com gelatina.

Semeie a suspensão SMC humana primária nos poços. Transfira a placa de poço contendo ECIS para um suporte de placa conectado a um amplificador e sistema de aquisição de dados, garantindo o contato do eletrodo com o suporte. Aplique uma pequena corrente alternada constante entre os eletrodos para medir o potencial entre eles.

Durante a incubação, os SMCs aderem e se espalham no revestimento de gelatina. As células se comportam como isolantes, limitando o fluxo de corrente entre os eletrodos. À medida que mais células se ligam à superfície, o fluxo de corrente diminui ainda mais. Como resultado, a impedância, ou oposição ao fluxo de corrente, e o potencial aumentam. Eventualmente, as células proliferam nos eletrodos e formam uma monocamada.

Trate os SMCs com um ionóforo de cálcio para facilitar o transporte de íons cálcio através das membranas celulares. O influxo extracelular de íons cálcio ativa o aparelho contrátil, induzindo a contração.

Os SMCs estimulados se contraem e perdem o contato célula-célula nos eletrodos. A redução resultante na cobertura da superfície do eletrodo diminui a impedância, facilitando a quantificação em tempo real da contração do SMC.

Conte as células usando um contador de células automatizado e semeie os SMCs em triplicado a uma densidade de semeadura de 30.000 células por poço, em 200 microlitros de meio SMC na placa ECIS revestida com gelatina. Coloque a placa com os SMCs no suporte de 96 poços ECIS na incubadora de cultura de células.

Clique duas vezes no "software ECIS Applied Biophysics" para abrir o programa e pressione o botão "Setup". Verifique se todos os eletrodos estão em contato com o suporte, no painel inferior esquerdo denominado "Configuração do poço". Se os eletrodos não estiverem conectados corretamente, ajuste a placa no suporte antes de iniciar a medição.

Agora, selecione o tipo de placa no mesmo painel clicando em "Tipo de matriz". Em seguida, prepare duas pipetas com volume de 2 microlitros e 150 microlitros. Antes de iniciar a estimulação, pressione "Mark" no software e faça um comentário.

Para estimular as células, remova a tampa e coloque-a em uma superfície estéril dentro da incubadora. Em seguida, induza a contração do SMC pipetando 2 microlitros da solução de trabalho de ionomicina em cada poço o mais rápido possível.

Uma vez que todas as células tenham sido estimuladas, misture o meio nos poços usando a segunda pipeta.