O ensaio de filamento de actina deslizante: um ensaio de motilidade in vitro para estudar a translocação de filamentos de actina em miosinas imobilizadas
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 6:01 min. • July 8th, 2025
A miosina - uma proteína motora - interage com outra proteína filamentosa, a actina, causando sua translocação.
Para analisar o movimento de deslizamento da actina, monte uma câmara de fluxo de vidro baseada em lâminas de modo que a parte interna do topo da câmara seja revestida com nitrocelulose. Flui nas proteínas da miosina através da câmara, que imobilizam sobre o revestimento de nitrocelulose.
Complemente a câmara com filamentos de actina não marcados - actinas pretas - e adicione um tampão de motilidade contendo trifosfato de adenosina ou moléculas de ATP.
Os filamentos de actina se ligam a miosinas ativas imobilizadas junto com miosinas inativas ou mortas. As moléculas de ATP interagem com as miosinas ativas, levando à sua dissociação das actinas negras, enquanto as miosinas inativas permanecem ligadas à actina.
Centrífuga para peletizar miosinas inativas ligadas a actinas negras. Enxágue bem com um tampão para remover o pellet de miosina inativo, filamentos de actina livres e ATPs não utilizados. Fluxo em actina marcada com fluorescência que se liga a miosinas ativas imobilizadas.
Suplementar a câmara com um tampão final contendo um agente de aglomeração - metilcelulose e A
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