Ensaio de Motilidade Invertida: Uma Técnica In Vitro para Visualizar o Movimento da Miosina em Filamentos de Actina Imobilizados

A miosina - uma proteína motora - tem um domínio globular da cabeça que interage com a actina - uma proteína filamentosa. Essa interação é essencial para a translocação da miosina ao longo dos filamentos de actina. Para estudar essa ligação in vitro, realize um ensaio de motilidade invertida de miosina sobre actina ligada à superfície.

Para começar, monte uma câmara de ensaio colocando uma lamínula revestida com polietilenoglicol biotinilado - PEG sobre uma lâmina de microscópio de modo que a superfície revestida fique voltada para dentro, criando a parte superior da câmara.

Passe uma solução contendo avidina - uma glicoproteína - pela câmara. A avidina liga-se à biotina com alta afinidade, o que aumenta a adesão à actina. Em seguida, flua em filamentos de actina marcados com biotina marcados com um fluoróforo vermelho. O ligante de biotina se liga à avidina, imobilizando os filamentos na superfície da lamínula.

Finalmente, adicione proteínas de miosina 5A marcadas com proteína fluorescente verde em um tampão contendo moléculas de trifosfato de adenosina, ou ATP. A miosina 5A de duas cabeças, contendo uma cabeça posterior e uma cabeça principal, interage com os filamentos de actina