Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:24 min. • July 8th, 2025
O trifosfato de adenosina, ATP, a principal fonte de energia celular, é vital para diversas funções celulares. Sob estresse, os níveis de ATP intracelular são impactados negativamente, tornando o ATP um bom marcador para células viáveis e metabolicamente ativas.
Para começar, semeie a suspensão de células tumorais em uma microplaca de parede preta e fundo transparente para dispersão mínima de luz durante a medição da intensidade da luz. A microplaca consiste em um revestimento de hidrogel que impede que as células adiram à placa, permitindo a interação célula a célula e a automontagem em organoides tumorais - culturas de tecidos tridimensionais que imitam o microambiente tumoral.
Em seguida, trate com um composto de teste. O composto de teste interage com as células organoides e, dependendo de seu potencial inibidor de crescimento, pode interromper os processos metabólicos de produção de energia, resultando em depleção de ATP intracelular.
Após o tratamento, adicione um reagente de uma etapa composto por detergentes, inibidores da ATPase, a enzima luciferase, substrato específico da luciferase, luciferina e íons de magnésio. Incube pela duração desejada.
O detergente solubiliza as membranas celulares, causando lise celular e extração de ATP em solução, enquanto os inibidores de ATPase inativam quaisquer ATPases endógenas liberadas, estabilizando o ATP.
Após sua extração, o ATP, na presença de íons de magnésio, facilita a ligação da luciferina à luciferase, que oxida a luciferina em oxiluciferina de alta energia que, após o relaxamento, gera um fóton bioluminescente.
Usando um luminômetro, meça a intensidade da luz produzida pelos fótons, representativa da concentração de ATP intracelular. Quantidades menores de ATP indicam menor viabilidade celular, sugerindo maior potencial inibidor de crescimento do composto de teste.
Após 24 horas de troca do meio, pique os organoides tumorais usando um instrumento de fragmentação e dispersão celular, equipado com um porta-filtro contendo um filtro de malha de 70 micrômetros. Diluir 15 milímetros de suspensão organoide tumoral 10 vezes.
Use o dispensador de suspensão celular para semear 40 microlitros de suspensão organoide tumoral diluída em uma microplaca esferóide de fixação ultrabaixa de 384 poços.
Após 24 horas, use um manipulador de líquidos para adicionar 0,04 microlitros de soluções de agente de teste de 10 diluições em série nas faixas de concentração final de 20 micromolares a 1,0 nanomolar nos poços e incube a placa por 6 dias.
No final da incubação, adicionar reagente de medição de ATP intracelular nos alvéolos de ensaio. Use um misturador para misturar o conteúdo do prato e incube o prato por 10 minutos a aproximadamente 25 graus Celsius. Use um leitor de placas para medir o conteúdo de ATP intracelular como luminescência.