JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:29 min • July 8th, 2025
As células intestinais produzem espécies reativas de oxigênio - ROS. Níveis moderados de ROS mantêm a homeostase celular, enquanto altos níveis de ROS podem causar morte celular.
Para quantificar os níveis de ROS in vitro, comece com uma cultura de organoides 3D intestinais de camundongos. Esses organoides exibem arquitetura de epitélio intestinal com saliências semelhantes a criptas que abrigam células-tronco verdes que expressam fluorescência. Eles também contêm células diferenciadas semelhantes a vilosidades na periferia, circundando o lúmen central compreendendo células mortas e detritos. Todas essas células produzem diferentes níveis de ROS.
Agora, trate os organoides nos poços designados com moduladores ROS. Com base em sua natureza, os moduladores podem atuar como indutores ou inibidores de ROS. Depois de incubar pelo tempo necessário, remova o meio gasto.
Adicione uma enzima proteolítica à cultura, interrompendo a arquitetura 3D dos organoides e liberando diferentes células em suspensão. Em seguida, adicione uma sonda fluorogênica sensível a ROS e incuba.
Ao entrar nas células, as sondas reagem com ROS e são oxidadas para produzir fluorescência vermelha. Trate as células com DAPI - um corante fluorescente de ligação ao DNA - que mancha seletivamente os núcleos das células mortas - criando um contraste com as células vivas.
Usando um citômetro de fluxo, analise as células vivas DAPI-negativas para obter um sinal de fluorescência vermelho correspondente ao seu nível de ROS. Dependendo da natureza dos moduladores, os indutores aumentam os níveis de ROS enquanto os inibidores os diminuem.
Adicionar 1 microlitro da solução-mãe de N-acetilcisteína nos alvéolos de controlo negativo da placa de fundo redondo de 96 poços que contém os organoides.
Após uma incubação de 1 hora, adicione 1 microlitro de solução estoque de hidroperóxido de terc-butila nos poços correspondentes e incube por 30 minutos. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM conectado e transfira-o para outra placa de fundo redondo de 96 poços. Mantenha este prato de lado.
Em seguida, adicione 100 microlitros de tripsina e, usando uma pipeta multicanal, pipete para cima e para baixo cinco vezes para destruir o BMM. Após uma curta incubação de 5 minutos, dissocie os organoides pipetando para cima e para baixo uma segunda vez.
Gire a placa e descarte o sobrenadante invertendo a placa. Adicione o meio previamente coletado em outra placa de 96 poços, de volta aos poços correspondentes, e ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo cinco vezes.
Em seguida, adicione 1 microlitro da sonda fluorogênica e incube por 30 minutos. Em seguida, gire a placa novamente e ressuspenda as células com 250 microlitros de solução DAPI. Transfira as amostras em tubos de citometria de fluxo e mantenha os tubos no gelo.
Otimize as configurações de tensão de dispersão direta e lateral em controle não corado e tensões de laser, para cada fluoróforo usando amostras monocoradas. Em seguida, usando uma estratégia de bloqueio apropriada, colete um mínimo de 20.000 eventos.