Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

A SUMOilação ocorre devido à ligação de pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina, SUMOs, às proteínas do substrato.

A SUMOilação ocorre quando um peptídeo SUMO maduro é ativado por uma enzima - E1. Após a ativação, o SUMO é transferido para o sítio ativo da enzima conjugadora - E2 - ligando o SUMO ao resíduo de lisina da proteína substrato. Outra ligase - E3 - aumenta a eficiência dessa interação.

Para realizar um ensaio de SUMOilação in vitro, comece com um tubo contendo uma mistura da proteína substrato - p53, enzimas e peptídeos SUMO e incube para induzir a SUMOilação. Suplementar o tubo com dodecil sulfato de sódio - tampão contendo SDS, terminando a reação. Aqueça a amostra para desnaturar as proteínas.

Carregue a mistura de proteínas no poço de um gel SDS-PAGE e faça eletroforese. As proteínas SUMOiladas de maior peso molecular movem-se mais lentamente do que suas variantes não SUMOiladas, gerando duas bandas distintas.

Transfira o gel para uma membrana de blotting presente em um papel de filtro úmido em um aparelho de eletroblotting. Cubra com um papel de filtro úmido e transfira eletro-as proteínas do gel para a membrana.

Trate a membrana com anticorpos anti-p53, que se ligam ao p53. Sobreposição com anticorpos secundários conjugados com enzimas que se ligam a complexos anticorpo-p53. Adicione um substrato quimioluminescente para gerar o produto luminescente e criar uma imagem da membrana.

Uma banda de peso molecular mais alta corresponde às proteínas SUMOiladas, enquanto a banda inferior corresponde às variantes de proteínas não SUMOiladas.

Adicione 3 microlitros de 100 nanogramas por microlitro de tag-K-bZIP purificado na reação in vitro da mistura mestre de SUMOilação. Em seguida, misture o conteúdo da mistura principal suavemente e incube a 30 graus Celsius por 3 horas.

Em seguida, adicione 20 microlitros de 2x SDS-PAGE com tampão de carregamento para interromper a reação. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 5 minutos para desnaturar a proteína.

Em seguida, carregue 20 microlitros da amostra em um gel SDS-PAGE a 10% e execute o gel a 80 volts por cerca de 120 minutos até que o corante atinja o fundo do gel.

Terminada a eletroforese, desconecte o aparelho de gel e transfira o gel em tampão de transferência semi-seco por 5 minutos. Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em outro recipiente cheio de metanol por 1 minuto.

Remova a membrana de PVDF do metanol e mergulhe em tampão de transferência semi-seco. Em seguida, agite suavemente a membrana por 5 minutos.

Remova a tampa de segurança do aparelho eletroforético semi-seco. Umedeça previamente um papel de filtro e prepare um sanduíche de gel na parte inferior do ânodo de platina. Depois de prender a placa catódica na tampa de segurança, execute o borrão a 15 volts de corrente constante por 90 minutos. Em seguida, desligue a fonte de alimentação e retire a membrana de PVDF, após desconectar o aparelho semi-seco.

Agora, bloqueie a membrana PVDF com tampão de bloqueio, por 1 hora à temperatura ambiente em um agitador orbital a 30 rotações por minuto. Em seguida, hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-p53 e tampão de bloqueio por 12 a 16 horas a 4 graus Celsius, em um misturador de suspensão a 30 rotações por minuto.

Em seguida, retire a membrana de PVDF e transfira para um recipiente cheio de solução salina tamponada com TRIS com Tween-20. Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em solução salina tamponada com TRIS com Tween-20 por 30 minutos no agitador orbital a 45 rotações por minuto. Em seguida, hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluída em tampão de bloqueio, por 1 hora em temperatura ambiente no misturador de suspensão a 30 rotações por minuto.

Em seguida, lave a membrana de PVDF com solução salina tamponada com TRIS com Tween-20 três vezes. Após a lavagem, embeber a membrana de PVDF em solução salina Tween-20 tamponada com TRIS durante 30 minutos no misturador de suspensão a 45 rotações por minuto. Em seguida, substitua a solução salina Tween-20 tamponada com TRIS por solução salina tamponada com fosfato para preservar a membrana de PVDF a 4 graus Celsius por até 12 horas.

Em seguida, misture os reagentes de substrato quimioluminescente aprimorados 1 e 2 na proporção de 1:1. Em seguida, remova a membrana de PVDF da solução salina tamponada com fosfato e seque brevemente com bolsas de punção para absorver o excesso de umidade.

Imediatamente, adicione 400 microlitros do reagente quimioluminescente à superfície da membrana e aguarde de 3 a 5 minutos. Seque brevemente para drenar o excesso de reagente quimioluminescente, evitando que a membrana seque completamente. Use o sistema de imagem de luminescência para expor a mancha.