Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

A SUMOilação ocorre devido à ligação de pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina, SUMOs, às proteínas do substrato.

A SUMOilação ocorre quando um peptídeo SUMO maduro é ativado por uma enzima - E1. Após a ativação, o SUMO é transferido para o sítio ativo da enzima conjugadora - E2 - ligando o SUMO ao resíduo de lisina da proteína substrato. Outra ligase - E3 - aumenta a eficiência dessa interação.

Para realizar um ensaio de SUMOilação in vitro, comece com um tubo contendo uma mistura da proteína substrato - p53, enzimas e peptídeos SUMO e incube para induzir a SUMOilação. Suplementar o tubo com dodecil sulfato de sódio - tampão contendo SDS, terminando a reação. Aqueça a amostra para desnaturar as proteínas.

Carregue a mistura de proteínas no poço de um gel SDS-PAGE e faça eletroforese. As proteínas SUMOiladas de maior peso molecular movem-se mais lentamente do que suas variantes não SUMOiladas, gerando duas bandas distintas.

Transfira o gel para uma membrana de blotting presente em um papel de filtro úmido em um aparelho de eletroblotting. Cubra com um papel de filtro úmido e transfira eletro-as proteínas do gel para a membrana.

Trate a membrana com anticorpos anti-p53, que