Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Proteínas nucleares mal dobradas sem uma estrutura terciária definida são marcadas com pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina, SUMOs e moléculas de ubiquitina, que facilitam sua degradação pelo sistema proteolítico, incluindo o sistema ubiquitina-proteassoma, o UPS.
Em várias doenças neurodegenerativas, a disfunção do UPS causa o acúmulo e a agregação de proteínas nucleares mal dobradas, levando à morte neuronal.
Para investigar a taxa de degradação de proteínas nucleares mal dobradas in vitro, trate uma cultura de células de mamíferos aderentes com uma mistura composta por um DNA de plasmídeo codificador de proteína mal dobrado marcado com fluorescência e um reagente de transfecção.
As células transfectadas com sucesso expressam proteínas mal dobradas de meia-vida curta marcadas com fluorescência marcadas com um sinal de localização nuclear. Após o transporte para o núcleo, essas proteínas mal dobradas sofrem SUMOilação e ubiquitinação e são transferidas para o UPS para degradação e depuração de proteínas.
Após a incubação, substituir o meio por um meio de baixa fluorescência contendo cicloheximida. A cicloheximida, uma molécula permeável às células, liga-se à grande unid
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