JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 2:59 min • July 8th, 2025
Proteínas nucleares mal dobradas sem uma estrutura terciária definida são marcadas com pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina, SUMOs e moléculas de ubiquitina, que facilitam sua degradação pelo sistema proteolítico, incluindo o sistema ubiquitina-proteassoma, o UPS.
Em várias doenças neurodegenerativas, a disfunção do UPS causa o acúmulo e a agregação de proteínas nucleares mal dobradas, levando à morte neuronal.
Para investigar a taxa de degradação de proteínas nucleares mal dobradas in vitro, trate uma cultura de células de mamíferos aderentes com uma mistura composta por um DNA de plasmídeo codificador de proteína mal dobrado marcado com fluorescência e um reagente de transfecção.
As células transfectadas com sucesso expressam proteínas mal dobradas de meia-vida curta marcadas com fluorescência marcadas com um sinal de localização nuclear. Após o transporte para o núcleo, essas proteínas mal dobradas sofrem SUMOilação e ubiquitinação e são transferidas para o UPS para degradação e depuração de proteínas.
Após a incubação, substituir o meio por um meio de baixa fluorescência contendo cicloheximida. A cicloheximida, uma molécula permeável às células, liga-se à grande unidade ribossômica e bloqueia a fase de alongamento da tradução de proteínas e posterior síntese de proteínas, facilitando o estudo da taxa de degradação das proteínas traduzidas com fluorescência e mal dobradas.
Trate um conjunto de poços com um inibidor de proteassoma para bloquear a atividade do proteassoma e fazer com que as proteínas mal dobradas se acumulem. Usando um leitor de microplacas, meça a fluorescência das proteínas mal dobradas.
Um declínio dependente do tempo na fluorescência indica degradação de proteínas mal dobradas. As células tratadas com o inibidor de proteassoma exibem intensidade de fluorescência semelhante ao longo do tempo, denotando a inibição da degradação da proteína mal dobrada.
Após semear e transfectar células HeLa em placas de 96 poços de acordo com o protocolo de texto; 20 a 24 horas após a transfecção, examine as células quanto à expressão de GFP. Remova o meio a aproximadamente 200 microlitros de 1x PBS para cada poço e, em seguida, aspire-o para remover o DMEM residual.
Adicione 60 microlitros de DMEM de baixa fluorescência com 5% de FBS e 50 microgramas por mililitro de cicloheximida e adicione 10 micromolares de MG132 a um conjunto de amostras.
Com um leitor de placas de fluorescência, meça o sinal GFP lendo as placas a cada hora por até 8 a 10 horas. Exporte os dados e realize análises estatísticas de acordo com o protocolo de texto.