JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 2:36 min • July 8th, 2025
A luciferase é uma enzima que oxida seu substrato para formar um produto bioluminescente.
Esta propriedade da luciferase é útil para projetar um sistema repórter baseado em nanoluciferase no qual a versão dividida da enzima é usada. Nesse sistema, os fragmentos menores e maiores possuem uma alta afinidade de ligação entre si e podem reconstituir a enzima funcional.
Para usar o sistema baseado em nanoluciferase para detectar a proteína-alvo - domínio de ligação ao receptor da glicoproteína spike SARS-CoV-2 - comece com uma placa de cultura contendo células aderentes. Essas células contêm um plasmídeo que codifica a proteína alvo em conjunto com uma sequência específica para o fragmento menor de nanoluciferase projetada.
Após a expressão, as células cultivadas produzem biorepórteres - proteínas-alvo recombinantes fundidas com o fragmento menor da luciferase. Trate as células com um tampão de lise e incube sob agitação. Os componentes tampão lisam rapidamente as células - liberando o conteúdo celular, incluindo os biorrepórteres, no sobrenadante.
Transfira o sobrenadante para uma placa de ensaio multipoços. Suplementar cada poço com a solução que contém os grandes fragmentos de nanoluciferase dividida e incubar.
Durante a incubação, o grande fragmento se liga espontaneamente à pequena subunidade do biorepórter e atinge uma conformação funcional. Adicione uma solução contendo furimazina - o substrato e coloque a placa de ensaio em um luminômetro.
A enzima funcional oxida a furimazina, emitindo um sinal luminescente brilhante. A magnitude do sinal se correlaciona com a concentração da proteína alvo.
Para avaliar o sinal luminescente do biorepórter usando um ensaio de luciferase, primeiro prepare os componentes da reação e use o sobrenadante como fonte do biorepórter.
Dilua o LgBiT e o substrato para 1x antes de usar. Transfira 50 microlitros do sobrenadante de cada poço ou tubo para uma placa de 96 poços e adicione 50 microlitros de 1x LgBiT a cada poço. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
Abra o software do luminômetro. Adicione 50 microlitros de substrato 1x a cada poço. Coloque a placa no luminômetro e execute o software.