Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:11 min. • July 8th, 2025
Durante a infecção por coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave, ou SARS-CoV-2, o domínio de ligação ao receptor da proteína spike do vírus, RBD, liga-se à enzima conversora de angiotensina 2 da célula hospedeira, ACE2, facilitando a entrada nas células virais. Em resposta, o sistema imunológico produz anticorpos que se ligam ao RBD viral e impedem a entrada celular, reduzindo a infectividade viral.
Para detectar anticorpos SARS-CoV-2 direcionados ao RBD, use uma suspensão recombinante de biorepórter composta por fragmentos de proteína de tamanho pequeno, fundidos ao RBD de pico SARS-CoV-2. Adicione anticorpos SARS-CoV-2 padrão direcionados ao RBD e esferas magnéticas de ligação a anticorpos.
Durante a incubação, a região do anticorpo Fc se liga aos domínios de ligação Fc dos grânulos. Além disso, o biorrepórter recombinante se liga aos anticorpos SARS-CoV-2 direcionados ao RBD ligados ao grânulo.
Pós-incubação, centrifugue a mistura. Remova o sobrenadante contendo biorepórter não vinculado. Ressuspenda os cordões encadernados no buffer. Transfira para uma placa de vários poços.
Adicione uma solução contendo fragmentos de proteínas de tamanho grande, com alta afinidade por fragmentos de proteínas de tamanho pequeno. Fragmentos de proteínas grandes e pequenos se ligam, formando uma enzima luciferase modificada ativa.
Adicione furimazina, um substrato de luciferase. A luciferase catalisa a oxidação da furimazina, causando emissão de luz. Usando um luminômetro, meça a luminescência, indicativa da presença de anticorpos neutralizantes.
Altas intensidades de sinal sugerem altas concentrações de anticorpos SARS-CoV-2 direcionados ao RBD.
Para realizar o ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD, prepare o biorepórter HiBiT-RBD e combine 50 microlitros do sobrenadante contendo HiBiT-RBD com 1 micrograma do anticorpo comercial SARS-CoV-2-RBD em um microtubo de 1,5 mililitro.
Adicione 20 microlitros de proteína de ligação à imunoglobulina, ou proteína G, à solução. Traga o volume total para 300 microlitros adicionando PBS. Incubar os tubos em um agitador ou rotador de tubos por 30 minutos, centrifugar a 12.000 x g por 30 segundos, depois descartar o sobrenadante e lavar com PBS. Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD livre.
Ressuspenda as células em 50 microlitros de PBS e transfira-as para uma placa de 96 poços. Adicione 50 microlitros de 1x LgBiT e aguarde 5 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato 1x NanoLuc. Leia imediatamente o sinal de luminescência com um luminômetro.