Ensaio de Paralisia Fluorescente Baseado em Repórter: Uma Técnica para Avaliar a Formação Progressiva Associada à Idade de Poliglutamina Repórter Fluorescente e Paralisia Associada em Caenorhabditis elegans

A homeostase das proteínas celulares, ou proteostase, envolve a regulação do dobramento e função das proteínas, juntamente com a degradação das proteínas mal dobradas. Durante o envelhecimento, a maquinaria da proteostase diminui, fazendo com que proteínas mal dobradas se acumulem e se agreguem ainda mais, resultando em disfunção celular.

Para determinar o declínio da proteostase associado à idade, comece com Caenorhabditis elegans adultos transgênicos sincronizados com o desenvolvimento.

As células musculares desses vermes expressam proteínas com repetições de poliglutamina anormalmente expandida, ou polyQ, fundidas com uma etiqueta fluorescente. As proteínas PolyQ são propensas a dobramentos incorretos e, portanto, após o acúmulo, podem formar agregados.

Transfira os vermes para uma lâmina de microscópio composta por uma almofada de agarose e imobilize com um produto químico adequado para imagens de células vivas. Usando um microscópio de fluorescência, visualize os músculos da parede do corpo dos vermes durante um período de tempo para determinar os sinais de focos fluorescentes brilhantes, correspondentes aos agregados poliQ fluorescentes.

Em poucos dias, devido ao declínio da proteostase relacionada à idade, ocorre acúmulo progressivo de agregados poliQ, levando a um maior número de focos fluorescentes. O aumento dos agregados polyQ nas células musculares causa toxicidade e interrompe a função das células musculares, resultando em paralisia.

Sob um microscópio, registre o número de vermes vivos e paralisados sem movimento por estímulos mecânicos. O aumento da taxa de paralisia do verme sugere o declínio da proteostase associado à idade no tecido muscular dos vermes.

Para medir o declínio da proteostase no tecido muscular, escolha 20 animais e monte-os em uma lâmina de microscópio com uma almofada de agarose a 3% e uma gota de 5 microlitros de azida sódica de 10 milimolares.

Depois que todos os vermes estiverem imobilizados, imagine todo o corpo dos animais usando uma lente de ampliação de 10x. Use um filtro FITC ou YFP e a mesma exposição para todos os animais. Quando terminar, descarte os slides.

Conte o número de focos nos músculos da parede corporal de todo o animal. Os focos são sinais mais brilhantes e pontuados que podem ser diferenciados do sinal solúvel mais fraco no fundo.

Nos dias de pontuação, olhe para as placas com os animais e registre o número de animais paralisados. Em seguida, remova os animais paralisados do prato.

Na conclusão do experimento, calcule a taxa de paralisia para cada condição e trace a progressão da paralisia.