Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificada: um ensaio de proximidade baseado em esferas para rastrear pequenas moléculas que inibem as interações proteína-proteína

Em sistemas biológicos, a proximidade de uma proteína com seu parceiro específico é um determinante crucial da interação proteína-proteína bem-sucedida. Com pequenas moléculas inibitórias presentes, essas proteínas não podem se mover próximas umas das outras, interrompendo suas interações.

Para rastrear moléculas inibitórias para interromper as interações entre duas proteínas - uma chaperona e uma co-chaperona - pegue uma placa de vários poços contendo várias moléculas pequenas. Complemente os poços com contas doadoras com co-chaperonas presas às suas superfícies. Esses grânulos contêm fotossensibilizadores para ensaio de quimioluminescência.

Adicione uma pasta de grânulos aceptores conjugados às sequências peptídicas derivadas da chaperona que se ligam especificamente à co-chaperona. As contas contêm um corante à base de tioxeno e fluoróforos essenciais para a visualização.

Em poços com moléculas não inibitórias, altas afinidades entre os peptídeos de ligação a chaperonas e co-chaperonas atraem os grânulos aceptores e doadores. Enquanto as esferas permanecem distantes quando os inibidores estão presentes.

Usando um leitor de quimioluminescência, estude a interação. Após a iluminação em um comprimento de onda específico, os fotossensibilizadores de esferas doadoras emitem oxigênios singlete altamente reativos.

Sem moléculas inibitórias, as espécies emitidas atingem grânulos aceptores próximos e reagem com moléculas de corante, causando quimioluminescência. Essa energia ativa os fluoróforos das esferas aceptoras, causando emissão de luz.

Em contraste, nos poços com moléculas inibitórias, os oxigênios singlete sofrem decaimento, levando a uma ausência de emissão de luz, indicando inibição bem-sucedida das interações proteína-proteína.

Adicione grânulos doadores de glutationa na concentração de 10 microgramas por mililitro em PBS. Adicione GST-FKBP51 a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incube a reação por 10 minutos a 25 graus Celsius no escuro.

Faça diluições em série do composto de teste em DMSO. Adicione 0,25 microlitros de diluições de composto de teste em triplicata, no canto de cada poço de uma placa de 384 poços.

Para controle negativo, adicione 0,25 microlitros de DMSO e, para controle positivo, adicione 0,25 microlitros de peptídeo C-terminal Hsp90 nos poços.

Adicione 22,5 microlitros da solução contendo grânulos doadores de glutationa com proteínas marcadas com GST em cada poço. Agite bem o prato com as mãos e incube no escuro a 25 graus Celsius por 15 minutos.

Dilua as esferas aceitadoras com o peptídeo C-terminal Hsp90 anexado a 100 microgramas por mililitro de concentração em 0,5x PBS. Adicione 2,25 microlitros de grânulos aceitadores diluídos a cada poço. Agite e incube a placa no escuro por 15 minutos, conforme demonstrado.

Ligue o instrumento leitor de placas, meça o sinal da placa e analise os dados conforme descrito no manuscrito do texto.