JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:43 min • July 8th, 2025
Para começar, prepare diluições em série do vírus herpes simplex, um vírus infeccioso envelopado, em buffer.
Obtenha uma placa de vários poços contendo uma monocamada de cultura de células epiteliais suscetíveis ao vírus. Substitua o volume específico de mídia por suspensões virais diluídas, garantindo uma cobertura uniforme em monocamada. Permita que o vírus seja adsorvido na superfície da célula.
Remova todos os vírus não adsorvidos. Cobrir a monocamada celular com meios contendo metilcelulose, formando uma camada semi-sólida.
Após a incubação, o envelope viral e a membrana celular se fundem, liberando o nucleocapsídeo viral envolvendo o genoma de fita dupla no citoplasma. Além disso, o genoma viral é liberado no núcleo da célula.
Usando a maquinaria celular do hospedeiro e a proteína do vírion, o genoma viral expressa proteínas virais precoces imediatas, que regulam a expressão de genes iniciais. As proteínas virais precoces medeiam a replicação do DNA viral.
Então, os genes virais tardios expressam proteínas estruturais, que junto com o genoma viral se reúnem para produzir partículas de vírion progênie. As células infectadas pelo vírus lisam, liberando vírions.
A metilcelulose restringe o movimento do vírus, fazendo com que os vírions infectem apenas as células vizinhas e subsequente lise, criando buracos na monocamada.
Após a incubação, remova a cobertura de metilcelulose. Adicione a solução de cristal violeta etanólico. O etanol fixa as células e inativa os vírus, enquanto o cristal violeta mancha as células. Como resultado, zonas ou placas lisadas claras aparecem na monocamada de células roxas.
Conte as placas em cada poço em cada diluição do vírus para determinar o título ou concentração do vírus infeccioso.
Remover o meio de cultura celular de um ou dois alvéolos com uma pipeta. Com cuidado, adicione a amostra de vírus diluída gota a gota a cada monocamada de células, gota a gota através da lateral de cada poço.
Repita o processo para cada um ou dois poços até que toda a placa esteja preenchida com as amostras de vírus que estão sendo plaqueadas. Balance suavemente todo o prato com a mão.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 1 hora para permitir a adsorção do vírus. A cada 10 minutos, remova a placa da incubadora, balance-a suavemente novamente para espalhar o vírus de maneira mais uniforme em cada poço e, em seguida, coloque-a de volta na incubadora.
Para diminuir a possibilidade de contar inadvertidamente o inóculo não absorvido, remova a amostra de vírus dos poços usando uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e descarte a amostra em um copo de resíduos.
Coloque 2,5 mililitros de uma camada de metilcelulose na placa e coloque-a de volta na incubadora. Desinfete o copo de resíduos, normalmente com a adição de alvejante, iodóforo ou virucida semelhante, antes de removê-lo do gabinete de biossegurança.
Após a incubação de dois dias, remova a camada de metilcelulose de um ou dois poços de cada vez, usando uma pipeta, e coloque-a em um copo de resíduos. Adicione aproximadamente 2 mililitros de violeta cristal a 1% e etanol a 50% em cada poço. Incube a placa com todos os poços preenchidos com a mancha por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Neste ponto, desinfete o copo de resíduos, conforme demonstrado anteriormente. Lave as placas vigorosamente com água da torneira, até que o escoamento esteja limpo.
Certifique-se de que existem diferenças de aproximadamente 10 vezes no número de placas em cada série de diluição.