Marcação final de dUTP intermediada por transferase terminal - ensaio TUNEL: um método in situ para detectar fragmentação de DNA em células apoptóticas

As células hospedeiras infectadas por patógenos microbianos sofrem apoptose - morte celular programada. Durante a apoptose, as DNases degradam o DNA cromossômico em pequenos fragmentos, levando à morte celular.

Para detectar a apoptose usando o ensaio TUNEL, pegue uma lâmina de vidro com uma seção de tecido cutâneo desparafinizado e reidratado infectado com um patógeno fúngico.

Trate o tecido com proteinase-K para inativar as DNases celulares, evitando que elas degradem potencialmente o DNA durante a análise. Adicione peróxido de hidrogênio para extinguir a reação e lave a lâmina para remover a proteinase-K não reagida.

Adicione um tampão contendo trifosfatos de desoxiuridina marcados com digoxigenina, ou dUTPs. Suplemente-o com uma desoxinucleotidil transferase terminal, enzima TdT e incube. Em células apoptóticas, a enzima TdT catalisa a ligação de dUTPs marcados aos grupos 3'-hidroxila expostos do DNA fragmentado.

Em seguida, adicione um anticorpo anti-digoxigenina conjugado a um repórter de rodamina e incube-o no escuro para facilitar a ligação do anticorpo a dUTPs marcados com digoxigenina, transmitindo fluorescência vermelha na imagem.

Trate as amostras de tecido com uma contracoloração nuclear fluorescente para visualizar os núcleos. Coloque uma lamínula sobre a seção de tecido e visualize-a sob um microscópio de fluorescência.

A fluorescência azul ajuda a identificar os núcleos de todas as células na seção do tecido, enquanto a presença de fluorescência vermelha nas células coradas com rodamina indica fragmentação do DNA devido à apoptose.

Para iniciar este procedimento, prepare lâminas de vidro hidrofílicas com tecido de amostra, conforme descrito no protocolo de texto.

Para desparafinizar os cortes de tecido, lave as lâminas três vezes com xileno, por 5 minutos cada, em um frasco de coplin. Em seguida, lave as lâminas com etanol 100% duas vezes por 5 minutos cada. Em seguida, lave as lâminas com etanol 95% e etanol 70% por 3 minutos cada, depois lave as lâminas uma vez com PBS por 5 minutos.

Para preparar lâminas experimentais e de controle negativo, pré-trate o tecido adicionando Proteinase K recém-diluída diretamente nas lâminas. Incube as lâminas por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas em PBS duas vezes por 2 minutos cada.

Para preparar lâminas de controle positivo, pré-trate o tecido com tampão DN e, em seguida, incube as lâminas em temperatura ambiente por 5 minutos. Depois disso, dissolveu a DNase I em tampão DN até uma concentração final de 0,1 microgramas por mililitro. Adicione a solução de DNA preparada às lâminas. Incube as lâminas por 15 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, lave as laterais com água destilada em um frasco de coplin cinco vezes, por 3 minutos cada.

Extinguir a reação em peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas em PBS duas vezes por dois minutos cada. Em seguida, adicione tampão de equilíbrio ao tecido nas lâminas. Incube por 10 segundos em temperatura ambiente e, em seguida, retire o excesso de líquido ao redor da seção de tecido.

Dilua a enzima desoxinucleotidil transferase terminal em tampão de reação e, em seguida, adicione-a ao tecido nas lâminas de controle experimental e positivo. Incube em uma câmara umidificada por 1 hora a 37 graus Celsius.

Depois disso, coloque as lâminas em um frasco de coplin contendo a concentração de trabalho do tampão de parada. Agite por 15 segundos e, em seguida, incube as lâminas em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas com PBS três vezes por 1 minuto cada e retire o excesso de líquido.

Em seguida, adicione o conjugado anti-digoxigenina pré-aquecido à temperatura ambiente diretamente no tecido. Incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara escura umidificada.

Após a conclusão da incubação, lave as lâminas com PBS quatro vezes por dois minutos cada. Retire o excesso de líquido. Em seguida, adicione o meio de montagem nas laterais. Adicione 15 microlitros de solução DAPI ao meio de montagem nas lâminas. Cubra cada lâmina com uma lamínula e sele com esmalte. Deixe as lâminas secarem no escuro.

Usando um microscópio fluorescente, observe as lâminas imediatamente após a conclusão do processo de coloração.

Tire fotos 400 vezes em intervalos aleatórios ao longo de cada seção da pele. Conte os glóbulos azuis corados com DAPI para garantir que pelo menos 100 células por seção de pele, por animal, sejam visíveis. Em seguida, conte o número de células positivas para TUNEL que aparecem como células únicas vermelhas com bordas de células claras.