JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 2:54 min • July 8th, 2025
A caspase-3 e a caspase-7 são proteases que reconhecem a sequência tetrapeptídica DEVD em proteínas-alvo, clivando-as no terminal C do resíduo de ácido aspártico. Estes desempenham um papel proeminente na apoptose - morte celular programada - cascata.
Para avaliar a atividade da caspase-3/7 em células apoptóticas, comece com um tubo contendo um explante de pele de dedo do pé de rã infectado com fungos indutores de apoptose. Adicione um tampão adequado ao tubo e algumas contas metálicas.
Use o batimento de contas para romper as células da pele e liberar o conteúdo celular, incluindo as proteínas caspase-3/7. Centrifugue o tubo, peletizando detritos celulares e organelas. Aspire o sobrenadante rico em proteínas do tubo e pipete para os poços de uma placa de ensaio multipoços.
Suplementar os alvéolos com o reagente caspase luminogénica. Este reagente consiste em um substrato proluminescente contendo o peptídeo DEVD em uma solução tamponada contendo ATP, íons de magnésio e enzima luciferase.
Misture o conteúdo do poço e incuba. Durante a incubação, a caspase-3/7 cliva o substrato proluminescente, liberando aminoluciferina - um substrato para a luciferase - na solução.
Na presença de íons ATP e magnésio, a luciferase oxida a aminoluciferina liberada, gerando um produto bioluminescente. A quantidade de luz produzida durante a reação é proporcional à atividade da caspase.
Para extrair proteínas de uma amostra congelada de dedo do pé de rã, coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca de 1,5 mililitro, contendo 100 microlitros de tampão de amostra e duas esferas de aço inoxidável.
Use um batedor de contas na velocidade máxima para lisar as células. Depois disso, coloque o tubo no gelo por 3 minutos e, em seguida, centrifugue o tubo para coletar o sobrenadante.
Para realizar o ensaio de caspase 3/7 em uma placa de 384 poços, adicione 10 microlitros de tampão de amostra como branco e 10 microlitros de extrato de proteína em triplicata. Em seguida, pipete 10 microlitros de reagente de caspase 3/7 disponível comercialmente para o extrato de proteína e poços em branco. Em seguida, agite a placa suavemente por 15 segundos para misturar os dois reagentes.
Incube em temperatura ambiente e escuro por 30 minutos. Finalmente, use um leitor de placas luminescentes para medir a luminescência da amostra.