Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:54 min. • July 8th, 2025
A caspase-3 e a caspase-7 são proteases que reconhecem a sequência tetrapeptídica DEVD em proteínas-alvo, clivando-as no terminal C do resíduo de ácido aspártico. Estes desempenham um papel proeminente na apoptose - morte celular programada - cascata.
Para avaliar a atividade da caspase-3/7 em células apoptóticas, comece com um tubo contendo um explante de pele de dedo do pé de rã infectado com fungos indutores de apoptose. Adicione um tampão adequado ao tubo e algumas contas metálicas.
Use o batimento de contas para romper as células da pele e liberar o conteúdo celular, incluindo as proteínas caspase-3/7. Centrifugue o tubo, peletizando detritos celulares e organelas. Aspire o sobrenadante rico em proteínas do tubo e pipete para os poços de uma placa de ensaio multipoços.
Suplementar os alvéolos com o reagente caspase luminogénica. Este reagente consiste em um substrato proluminescente contendo o peptídeo DEVD em uma solução tamponada contendo ATP, íons de magnésio e enzima luciferase.
Misture o conteúdo do poço e incuba. Durante a incubação, a caspase-3/7 cliva o substrato proluminescente, liberando aminoluciferina - um substrato para a luciferase - na solução.
Na presença de ío
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