JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:48 min • July 8th, 2025
Os macrófagos são células imunes especializadas que eliminam as células submetidas à apoptose - morte celular programada por fagocitose.
Para avaliar o engolfamento celular apoptótico, comece com uma lâmina de vidro contendo células embrionárias fixas de Drosophila, incluindo corpos apoptóticos engolfados por hemócitos - macrófagos invertebrados.
Primeiro, trate as células com um reagente bloqueador que bloqueie os locais não específicos. Adicione anticorpos primários que se ligam aos receptores de croquemort - marcadores fagocíticos de hemócitos. Lave o excesso de anticorpos.
Adicione anticorpos secundários marcados com fosfatase alcalina que se ligam aos anticorpos primários. Agora, adicione uma solução de substrato cromogênico apropriada na lâmina e incube. Durante a incubação, a fosfatase alcalina reage com o substrato cromogênico para produzir grânulos corados de roxo nos hemócitos.
Em seguida, adicione uma mistura de reação compreendendo desoxinucleotidil transferase terminal, enzima TdT e nucleotídeos ligados à digoxigenina. TdT catalisa a ligação de nucleotídeos ligados à digoxigenina às extremidades 3 'OH expostas do DNA fragmentado nos corpos apoptóticos.
Em seguida, adicione anticorpos anti-digoxigenina conjugados à peroxidase repórter que se ligam aos nucleotídeos no local do dano ao DNA. Trate as células com uma solução de substrato cromogênico específico para peroxidase e incuba. A peroxidase catalisa a oxidação do substrato, gerando precipitados coloridos e manchando os corpos apoptóticos de marrom.
Finalmente, visualize as células sob um microscópio de luz. A co-presença de grânulos roxos e sinais marrons das células indica hemócitos contendo corpos apoptóticos fagocitados.
Para imunocorar as células com anticorpo anti-Croquemort, primeiro, embeba a lâmina em metanol e, em seguida, PBS suplementado com 0,2% de Triton X-100, seguido apenas de PBS. Em seguida, bloqueie a ligação não específica com 20 microlitros de soro suíno integral a 5% em PBS + Triton X-100 a 0,2%, por 20 minutos em temperatura ambiente. Remova o excesso de solução de bloqueio e rotule as células com 20 microlitros de anti-soro anti-Croquemort a 4 graus Celsius durante a noite.
Na manhã seguinte, lave a lâmina em PBS + Triton X-100 por cinco incubações de 10 minutos. Após a última lavagem, enxágue a lâmina em PBS por 10 minutos. Em seguida, rotule as células com 20 microlitros de IgG anti-rato marcada com fosfatase alcalina em temperatura ambiente por 1 hora.
No final da incubação, lave a lâmina cinco vezes em PBS + Triton X-100 conforme demonstrado, seguido de uma imersão de 10 minutos em solução tampão. Em seguida, rotule as células com solução de substrato de fosfatase e observe as células sob um microscópio óptico.
Quando fortes sinais roxos aparecerem nos grânulos de hemócitos, remova o excesso de substrato e mergulhe a lâmina em tampão suplementado com EDTA por 5 a 10 minutos. No final da incubação, enxágue as células com duas lavagens de PBS de 5 minutos e trate-as com tampão de equilíbrio por 10 minutos.
Depois de remover a solução, rotule as células com 20 microlitros de solução terminal de desoxinucleotidil transferase a 37 graus Celsius por 1 hora. Em seguida, remova a solução da lâmina e mergulhe as células em 0,5 mililitros de tampão de lavagem em 17 mililitros de água, por 10 minutos. Em seguida, enxágue as células com três lavagens de PBS de 5 minutos e rotule-as com 20 microlitros de anti-digoxigenina peroxidase por 30 minutos em temperatura ambiente.
No final da incubação, lave as células quatro vezes em PBS, conforme demonstrado, e mergulhe a lâmina em substrato de peroxidase por incrementos de 30 segundos até que as células apoptóticas fiquem marrons. Quando uma coloração ideal for alcançada, mergulhe a lâmina em água para interromper a reação da peroxidase.