JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 7:16 min • July 8th, 2025
Os oócitos na prófase-I da meiose são transcricionalmente ativos; eles produzem mRNAs e os armazenam em uma forma dormente. Durante a maturação, à medida que o oócito entra em metáfase, os mRNAs armazenados são traduzidos em proteínas.
Para estudar a tradução do mRNA, comece com oócitos de camundongo presos à prófase I suspensos em uma gota de meio. Posicione a pipeta de retenção perto de um único oócito para mantê-la na posição.
Pegue uma pipeta de microinjeção contendo uma mistura repórter. Esta mistura contém dois tipos distintos de mRNA, um que codifica a proteína fluorescente amarela, ou YFP - um repórter fundido com a região 3'-não traduzida do gene alvo - e um mRNA poliadenilado que codifica a proteína fluorescente vermelha.
Injete a mistura repórter no oócito. Incube os oócitos microinjetados em um meio de maturação suplementado com cilostamida - um inibidor químico que mantém a parada da prófase I.
O oócito traduz o mRNA poliadenilado até que a intensidade da fluorescência vermelha atinja um platô, enquanto os níveis de mRNA codificador de YFP sem uma cauda de poliadenilação permanecem como tal.
Transfira os oócitos tratados para um meio de maturação sem cilostamida, o que ajuda a retomar a meiose; e o mRNA alvo sofre tradução para produzir a proteína alvo fundida com repórter fluorescente amarelo.
Realize imagens de lapso de tempo para visualizar os sinais de fluorescência em intervalos regulares.
Os oócitos injetados apresentam níveis constantes de fluorescência vermelha, enquanto a fluorescência amarela aumenta com o tempo, indicando tradução e acúmulo gradual das proteínas repórteres.
Para começar, abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha de calibre 26. Isole os COCs intactos com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca. Use uma pipeta menor e desnude mecanicamente os COCs por pipetagem repetida.
Aspirar os ovócitos desnudos e colocá-los numa placa de Petri com meio de maturação suplementado com 1 micromolar de cilostamida. Coloque o prato em uma incubadora por duas horas, para permitir que os oócitos se recuperem do estresse induzido pelo isolamento dos folículos.
Coloque um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 centímetros de comprimento e um extrator mecânico para preparar as agulhas de injeção. Dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45 graus usando um filamento aquecido para injeção ideal. Coloque gotículas de 20 microlitros de meio básico de coleta de oócitos em uma placa de poliestireno e cubra as gotículas com óleo mineral leve.
Prepare um volume maior de repórter mix adicionando 12,5 microgramas por microlitro de Ypet UTR e mCherry cada. Armazene alíquotas destes a 80 graus Celsius negativos. Após o descongelamento, centrifugue a alíquota por dois minutos a 20.000 x g. Em seguida, transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga.
Carregue a agulha de injeção com aproximadamente 0,5 microlitros de mistura repórter. Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção nos suportes e posicione-os na gota do meio de coleta de oócitos.
Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção. Coloque os oócitos em uma gota de meio de coleta básico e injete 5 a 10 picolitros da mistura repórter. Incubar os ovócitos no meio de maturação com 1 micromolar de cilostamida durante 16 horas para permitir que o sinal mCherry estabilize.
Para microscopia de lapso de tempo, prepare uma placa de Petri com duas gotículas de 20 microlitros de meio de maturação para cada repórter injetado. Uma gota com 1 cilostamida micromolar para oócitos controlados com parada de prófase I e uma gota sem cilostamida para oócitos em maturação. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque-as na incubadora.
Após a pré-incubação, retirar os ovócitos injetados da incubadora e lavá-los quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Manter alguns ovócitos em meio de maturação com 1 cilostamida micromolar como grupo controle de oócitos prófase-I.
Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas na placa de microscópio de lapso de tempo previamente preparada. Agrupe os oócitos com uma pipeta de vidro fechada para evitar seu movimento durante a gravação.
Coloque a placa sob o microscópio equipado com um sistema de iluminação de diodo emissor de luz e uma platina motorizada equipada com uma câmara ambiental mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, usando os parâmetros mencionados no manuscrito do texto.
Insira as configurações apropriadas para o experimento de lapso de tempo clicando em "Aplicativos" e, em seguida, em "Aquisição multidimensional". Selecione a primeira guia "Principal" e selecione "Time-lapse", "Várias posições de estágio" e "Vários comprimentos de onda".
Selecione a guia "Salvar" para inserir o local onde o experimento deve ser salvo. Em seguida, selecione a guia "Lapso de tempo" para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo. Selecione a guia "Palco". Ligue o campo claro e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela e selecionando "Adquirir", "Adquirir" e "Mostrar ao vivo".
Assim que os oócitos estiverem localizados, volte para a "Janela de aquisição multidimensional" e pressione "+" para definir a localização dos oócitos. Selecione a guia "Comprimentos de onda" e defina três comprimentos de onda diferentes para campo claro, YFP e mCherry. Ajuste a exposição para Ypet e mCherry. Em seguida, inicie o experimento de lapso de tempo clicando em "Adquirir".
Para análise da tradução de Ypet-3' UTR, realizar duas medições de região para cada oócito. O próprio oócito cortando em "Região da elipse" e uma pequena região ao redor do oócito a ser usada para subtração de fundo clicando em "Região retangular". Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando em "Abrir registro" e, em seguida, em "Dados de registro".
Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito separadamente para os comprimentos de onda YFP e mCherry.