Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:01 min. • July 8th, 2025
O filme lacrimal - o fluido protetor que cobre o olho - ajuda a lubrificar e manter as células epiteliais da córnea ocular, CECs, em um estado saudável e metabolicamente ativo. Um filme lacrimal comprometido, como na doença do olho seco, pode causar evaporação lacrimal dos CECs, aumentando sua suscetibilidade a infecções e danos inflamatórios.
As formulações de lágrimas artificiais estabilizam o filme lacrimal e melhoram a retenção de água, evitando a desidratação celular.
Para rastrear os efeitos citotóxicos de uma formulação de lágrima artificial de teste em CECs usando o ensaio alamarBlue, comece com uma cultura aderente de CECs de origem humana em meios adequados. Descarte a mídia.
Incubar a cultura de células com uma concentração específica da formulação de lágrimas artificiais. A formulação lacrimal forma um revestimento sobre as células. Dependendo do efeito cumulativo dos ingredientes constituintes, as células podem sofrer uma perda na atividade metabólica.
Em seguida, adicione a solução alamarBlue contendo resazurina, um corante de cor azul, fracamente fluorescente, não tóxico e solúvel em água.
A resazurina se difunde nas células e é irreversivelmente reduzida em células metabolicamente ativas principalmente por redutases mitocondriais, pois aceita elétrons dos doadores de elétrons dos processos metabólicos respiratórios, formando uma resorufina de cor rosa e altamente fluorescente, que se move livremente para fora das células para a solução. Transfira a solução contendo resorufina para uma nova placa de vários poços.
Usando um leitor de placa de fluorescência, meça a intensidade da fluorescência. Um baixo valor de intensidade de fluorescência indica uma baixa atividade metabólica celular, sugerindo efeitos indesejáveis da formulação lacrimal sobre os CECs.
Remova o meio de cultura dos poços e trate imediatamente as células com 150 microlitros de uma formulação de teste ou solução de controle de meio. Em seguida, incube as células por 30 minutos.
Remova a solução de teste das células e adicione 0,5 mililitros de solução de corante metabólico a 10%. Incube as células por mais quatro horas.
Após a incubação, remova 100 microlitros de solução de corante de cada poço e transfira-o para uma placa de 96 poços. Use um leitor de placas para medir a fluorescência de cada poço, ajustando a excitação para 540 nanômetros e a emissão para 590 nanômetros.