Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:21 min. • July 8th, 2025
O intestino médio do inseto contém uma região de célula de cobre - CCR - que é responsável pela acidificação intestinal. Essa região contém células secretoras especializadas - células de cobre - que produzem ácido, que passa pelo canal estreito formado pelas células intersticiais vizinhas. O ácido é liberado no lúmen intestinal para ajudar na digestão.
Para monitorar a acidificação intestinal em Drosophila, pegue moscas adultas famintas por um período adequado. Coloque as moscas em uma placa de Petri contendo uma única gota de alimento para moscas suplementado com azul de bromofenol, ou BPB - um corante indicador com sensor de pH. Deixe as moscas famintas forragear por um período fixo.
Após a ingestão do alimento, o ácido produzido pelas células de cobre atinge o lúmen intestinal e se mistura com o alimento que contém BPB. Em um pH ácido, as moléculas de BPB são protonadas, o que muda de cor de azul para amarelo - indicando acidificação.
Após a conclusão da duração experimental, colocar a placa de Petri sobre gelo. Uma temperatura baixa cessa a atividade neuromuscular nas moscas e as anestesia. Coloque uma mosca individual sob um estereomicroscópio e isole cirurgicamente o trato digestivo intacto.
Examine a cor do CCR para determinar o status da acidificação intestinal. Uma coloração amarela indica acidificação, enquanto uma coloração azul indica a ausência de acidificação.
Inspecione o trato digestivo de todas as moscas e calcule a porcentagem de indivíduos que apresentam acidificação intestinal.
Comece a organizar o ensaio de monitoramento da acidificação intestinal com a preparação do alimento para moscas com azul de bromofenol com sensor de pH ou corante BPB. Para fazer isso, derreta a comida de mosca no micro-ondas e deixe esfriar até ficar morna. Adicione 1 mililitro de 4% de BPB a 1 mililitro do alimento morno com um poço de mistura. Usando uma pipeta, adicione o alimento para moscas contendo BPB em um único ponto de aproximadamente 200 microlitros no centro de uma placa de Petri.
Em seguida, colete moscas fêmeas não virgens de 0 a 2 dias de idade, Drosophila melanogaster, e permita que as moscas se recuperem com comida de fubá padrão. Antes do experimento, deixe as moscas morrerem de fome por 24 horas em temperatura ambiente em um frasco contendo um lenço de limpeza de laboratório embebido em aproximadamente 2 mililitros de água deionizada.
Transfira moscas famintas para uma placa de Petri contendo pontos únicos do alimento para moscas recém-preparado, suplementado com 2% de BPB, para permitir que as moscas forrageem por quatro horas em temperatura ambiente, enquanto expostas à luz.
Após quatro horas, colete as moscas. Em seguida, proceda ao isolamento cirúrgico das entranhas das moscas anestesiadas em 1x PBS com fórceps sob um estereomicroscópio. Conte o número de moscas que mostram coloração robusta de BPB no intestino e calcule a porcentagem usando a equação.