Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:58 min. • July 8th, 2025
Peptídeos que penetram nas células, CPPs, peptídeos curtos e carregados positivamente, podem interagir e atravessar as membranas celulares, facilitando a entrega de cargas impermeáveis às células.
Para estudar o potencial de permeabilização da membrana de um teste de CPP in vitro usando uma imitação de membrana celular, comece com uma grande vesícula unilamelar, LUV, suspensão.
Os LUVs compreendem uma bicamada fosfolipídica carregada com uma sonda fluorescente impermeável à membrana e o par de atenuadores correspondente. Dentro das vesículas, o supressor interage com a sonda fluorescente devido à sua proximidade, causando extinção de fluorescência.
Pipetar a suspensão LUV para uma cubeta de fluorescência de quartzo e diluir com tampão. Adicione uma barra magnética. Transferir para um espectrofluorómetro com agitação magnética para evitar a sedimentação do LUV durante a corrida. Determine a fluorescência de fundo para eliminar quaisquer vazamentos de LUV.
Adicionar a concentração desejada de CPP à suspensão LUV a intervalos regulares.
Com base na hidrofobicidade e carga dos resíduos de aminoácidos dos CPPs, eles perturbam a membrana lipídica LUV, levando à penetração e permeabilização da membrana.
O dano à membrana da vesícula causa vazamento da sonda fluorescente e do resfriamento na solução circundante, aumentando sua separação espacial. Como resultado, a sonda exibe fluorescência.
A adição adicional da solução CPP leva ao aumento da permeabilização do LUV e da intensidade de fluorescência. Um aumento na intensidade da fluorescência com a adição de CPP sugere o potencial de permeabilização da membrana do peptídeo.
Para medir o vazamento de fluorescência, dilua os LUVs em 1 mililitro de HEPES Buffer 2 em uma cubeta de fluorescência de quartzo até uma concentração final de 100 micromolares e adicione um agitador magnético para facilitar a homogeneização da solução durante o experimento.
Meça os LUVs sozinhos durante os primeiros 100 segundos para avaliar a fluorescência de fundo, antes de medir o vazamento como um aumento na intensidade de fluorescência após a adição de alíquotas de solução peptídica nos próximos 900 segundos.
Para medir 100% de vazamento de fluorescência como controle positivo, adicione 1 microlitro de Triton X-100 aos LUVs para solubilizar as vesículas, resultando em uma desextinção completa da sonda durante os últimos 100 segundos da análise. Em seguida, use a fórmula para calcular a porcentagem de vazamento em cada ponto de tempo.