Ensaio de proteína solúvel para quantificar o teor de proteína solúvel em tecidos vegetais

Para quantificar o teor de proteína solúvel em um tecido vegetal, em um tubo, comece com uma quantidade apropriada de tecido vegetal liofilizado moído.

Adicione hidróxido de sódio, um álcali, ao tubo e sonicate. O ambiente alcalino com as forças mecânicas perturba as células, liberando conteúdo intracelular, incluindo macromoléculas - proteínas solúveis e carboidratos. Incubar em temperaturas mais altas.

Na presença de calor, os álcalis causam hidrólise de proteínas, formando peptídeos menores e aumentando a solubilidade das proteínas. Além disso, os carboidratos são degradados.

Centrifugue a mistura. Colete o sobrenadante contendo proteínas solubilizadas. Adicione ácido clorídrico para neutralizar o pH.

Trate a amostra com ácido tricloroacético, TCA. O TCA interrompe a camada de hidratação ao redor das proteínas, levando à agregação de proteínas e precipitação.

Centrifugue e remova o sobrenadante contendo TCA. Lave o pellet de proteína com acetona gelada para remover qualquer TCA residual, que pode interferir na estimativa de proteína solúvel.

Seque a acetona ao ar. Ressuspenda o pellet de proteína em hidróxido de sódio. Diluir com água deionizada. Transfira para os poços de uma placa de vários poços.

Adicione uma solução ácida de corante Coomassie Brilliant Blue G-250. Sob condições ácidas, o corante se liga aos resíduos de aminoácidos básicos nas proteínas solubilizadas, resultando em um complexo de corante de proteína azul.

Use um espectrofotômetro para medir a absorbância do complexo proteína-corante, proporcional ao teor de proteína solúvel no tecido vegetal.

Para começar, pese amostras replicadas de cada tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados. Em seguida, registre a massa precisa de cada amostra. Usando um micropipetador, adicione 500 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar a cada tubo. Feche bem as tampas e sonice os tubos por 30 minutos.

Em seguida, coloque os tubos em banho-maria pré-aquecido por 15 minutos. Depois disso, centrifugue os tubos a 15.000 g por 10 minutos. Pipete o sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga rotulados usando uma nova ponta de pipeta para cada amostra.

Adicione 300 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar ao pellet e repita a centrifugação por 10 minutos. Em seguida, retirar o sobrenadante e transferi-lo para os tubos que contêm o sobrenadante da primeira centrifugação.

Para neutralizar o pH do sobrenadante, adicione 11 microlitros de ácido clorídrico 5,8 molar. Use papel de tornassol para confirmar que o pH é de aproximadamente 7.

Em seguida, adicione 90 microlitros de ácido tricloroacético 100% a cada tubo. Em seguida, incube os tubos no gelo por 30 minutos. Centrifugue as amostras a 13.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Com cuidado, use uma linha de vácuo e uma ponta de micropipeta de vidro para remover o ácido tricloroacético.

Tenha muito cuidado para não perturbar o pellet com a ponta de sucção.

Em seguida, lave o pellet com 100 microlitros de acetona resfriados a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, deixe a acetona evaporar em uma capela de exaustão. Dissolva o pellet de proteína com 1 mililitro de hidróxido de sódio. Rodadas adicionais de aquecimento, vórtice e sonicação podem ser necessárias.

Adicione 160 microlitros de cada solução padrão de IgG a uma placa de 96 poços em triplicata, começando com a posição A1. Em seguida, em um novo tubo de 1,5 mililitro, adicione 50 microlitros de cada solução de amostra a 950 microlitros de água destilada. Em seguida, adicione 60 microlitros de cada amostra diluída à placa do poço em triplicata, começando pela posição H1. Adicione 100 microlitros de água destilada a todos os poços de amostra em branco e desconhecidos.

Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 microlitros de corante de proteína G-250 azul brilhante Coomassie a cada poço da placa. Usando uma agulha, estoure todas as bolhas presentes nos poços. Depois disso, deixe a placa incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, use um espectrofotômetro de microplacas para registrar os valores de absorbância para cada poço em 595 nanômetros.