JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:34 min • July 8th, 2025
O Toxoplasma gondii - um protozoário unicelular - é um parasita anaeróbio obrigatório, reproduzindo-se apenas dentro das células hospedeiras.
Para quantificar o crescimento intracelular do parasita usando um ensaio baseado em luciferase, pegue uma suspensão de células do parasita que expressam luciferase - uma enzima que produz luminescência após a reação com seu substrato. Adicione a suspensão a uma cultura de fibroblastos do prepúcio humano e incube por um período adequado.
O parasita se liga aos receptores da célula hospedeira e é internalizado por meio de um processo endocítico, formando um vacúolo parasitóforo. A estrutura fornece um nicho para o parasita se reproduzir.
Pós-infecção, aspirar o meio, removendo os parasitas não internalizados. Adicione um tampão de lise contendo um detergente e luciferina - um substrato para luciferase. O detergente no tampão cria poros na membrana celular e lisa completamente as células, resultando na liberação de luciferase.
A enzima liberada oxida as moléculas de luciferina, emitindo luz. Meça a intensidade da luminescência para determinar a atividade da luciferase. Usando poços replicados contendo células hospedeiras infectadas, meça a atividade da luciferase em intervalos predeterminados após a infecção.
Plote a intensidade de luminescência normalizada versus os intervalos de tempo para obter as mudanças de dobra no crescimento do parasita ao longo do tempo. Um aumento temporal na intensidade indica uma multiplicação bem-sucedida do parasita.
Plote os valores em uma escala logarítmica para calcular a inclinação da curva, representando o tempo de duplicação do parasita.
Para realizar um ensaio de crescimento de Toxoplasma baseado em luciferase, comece aspirando cuidadosamente o meio de culturas de microplacas pré-semeadas de 96 poços de fibroblastos de prepúcio humano e inocule 150 microlitros de suspensão livre de parasitas nos poços em um formato de três colunas e cinco fileiras.
Após uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura de células, aspire cuidadosamente o meio de cada poço para remover os parasitas não invadidos e encha os poços em cada um, exceto na primeira fileira, com meio sem vermelho de fenol à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução de substrato de luciferase 12,5 micromolar em PBS em cada poço da linha superior e incube as microplacas por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir a lise celular completa.
No final da incubação, medir a atividade da luciferase num leitor de microplacas. Cada leitura representa o número inicial de parasitas invadidos quatro horas após a infecção. Repita a análise a cada 24 horas pelos próximos quatro dias sem alterar o meio.
Para calcular a mudança de dobra normalizada do crescimento do parasita, cada leitura pode ser dividida pela leitura inicial quatro horas após a infecção. O log2 da mudança de dobra normalizada do crescimento do parasita pode então ser plotado em relação a cada ponto de tempo e submetido a uma função de regressão linear para obter a inclinação, que representa o tempo de duplicação.