Ensaio de extração de msp1 para estudar a remoção de proteínas TA mal localizadas

Msp1, uma ATPase na membrana externa mitocondrial, remove proteínas ancoradas na cauda mal localizadas, ou TA, da membrana por meio de seu poro central hexamérica, facilitando sua degradação.

Para entender o mecanismo de translocação, co-reconstitua proteínas TA e Msp1 em lipossomas, permitindo sua integração na bicamada lipídica.

Preparar uma mistura de reacção adicionando os lipossomas reconstituídos a um tampão adequado contendo chaperonas — proteínas citosólicas de controlo da qualidade. As chaperonas são marcadas com a enzima glutationa-S-transferase ou GST.

Adicione trifosfato de adenosina - ATP - à reação. O Msp1 se liga às moléculas de ATP e as hidrolisa. Usando energia gerada por hidrólise, Msp1 transloca as proteínas TA ligadas à membrana através de seu poro central. As chaperonas na mistura de reação ligam-se ao domínio transmembrana das proteínas TA extraídas.

Em seguida, carregue a mistura de reação em uma coluna de purificação de afinidade. A coluna contém uma resina conjugada com glutationa reduzida ou GSH. A proteína GST nas chaperonas se liga ao GSH conjugado - seu substrato - ligando os complexos de proteína chaperona-TA à resina.

Gire a coluna para remover as pro