Ensaio de calcificação para medir a concentração de cálcio em células intersticiais da válvula aórtica

Os folhetos da válvula aórtica contêm uma população heterogênea de células intersticiais da válvula, ou VICs, distribuídas pelas camadas da matriz extracelular. Após a estimulação, os VICs se transformam em osteoblastos – células formadoras de matriz óssea.

Os osteoblastos maduros secretam colágeno e proteínas da matriz óssea. Essas proteínas ajudam os osteoblastos a se ligarem à matriz. Finalmente, os íons de cálcio intracelulares entram no meio da matriz e, junto com os fosfatos, depositam-se como nódulos mineralizados, levando à calcificação da valva aórtica.

Para avaliar a concentração de cálcio nas valvas aórticas calcificadas, comece com uma cultura de VICs em uma placa de seis poços. Descarte o meio de cultura, adicione um meio osteogênico ao poço e incuba.

Durante a incubação, a insulina no meio osteogênico estimula as VICs a se diferenciarem em fenótipos osteogênicos. Esses osteoblastos secretam proteínas da matriz óssea e ácido ascórbico no meio osteogênico, o que os induz a formar uma matriz extracelular rica em colágeno.

Finalmente, o cálcio intracelular dos osteoblastos e os fosfatos do meio formam cristais mineralizados no meio.

Remova o meio e adicione a solução de ácido clorídrico. Incube para solubilizar os íons de cálcio na solução. Dispense o meio ácido contendo cálcio no poço de uma placa de vários poços.

Adicione um corante sensível ao cálcio e incuba. As moléculas de corante se ligam aos íons de cálcio no meio ácido, formando um complexo de corante-cálcio de cor roxa.

Meça a absorvância do complexo, que é proporcional à concentração de cálcio na amostra.

Antes de iniciar o ensaio, limpe a coifa de biossegurança com etanol a 70% e aqueça o meio DMEM a 37 graus Celsius. Em seguida, semeie 100.000 células por condição em placas de 6 poços em DMEM completo e cultive a 37 graus Celsius.

Após 24 horas, substitua o meio sobrenadante pelo meio calcificante e incube as células por 7 dias a 37 graus Celsius, substituindo o meio no terceiro dia.

Após 7 dias, medir a concentração de cálcio numa placa de 96 poços utilizando o reagente Arsenazo III e registar a absorvância a 650 nanómetros.