JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:57 min • July 8th, 2025
No peixe-zebra, o material particulado fino do ambiente, ou PM - um poluente do ar - causa mau funcionamento cardíaco induzido pelo estresse oxidativo.
Para estudar o impacto do PM no peixe-zebra, comece expondo embriões de peixe-zebra à matéria orgânica extraível derivada de PM, EOM, que desencadeia a geração de espécies reativas de oxigênio, ou ROS.
ROS oxida a guanina base de DNA em 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina ou 8-OHdG e faz com que a fosforilação da histona H2AX forme γH2AX - um marcador para quebras de fita dupla de DNA.
Após a exposição, disseque o coração do peixe-zebra e coloque-o em uma lâmina de vidro. Trate o coração com uma solução fixadora que reticula as proteínas, estabilizando a estrutura celular.
Em seguida, adicione um reagente de bloqueio para evitar locais de ligação inespecíficos. Adicione anticorpos primários que têm como alvo γH2AX e 8-OHdG nas células cardíacas.
Em seguida, adicione dois anticorpos secundários marcados com fluorescência de cores diferentes que se ligam especificamente à região Fc de seu respectivo anticorpo primário. Finalmente, core a amostra com DAPI - uma coloração específica do DNA - que se liga ao sulco menor de sequências ricas em AT no DNA para formar um complexo fluorescente.
Coloque a lâmina sob um microscópio de fluorescência para observar os sinais da expressão de 8-OHdG e γH2AX no coração dos embriões de peixe-zebra tratados com EOM.
Uma intensidade de fluorescência significativamente alta das células cardíacas indica dano ao DNA oxidativo induzido por MOE e quebras de fita dupla.
Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em uma lâmina de vidro limpa. Adicione 50 microlitros de paraformaldeído a 4% a 1,25 microlitros de PBS para fazer uma solução fixadora. Em seguida, coloque três corações dissecados em um círculo de barreira hidrofóbica e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
Transvase a solução ao microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente durante pelo menos 5 minutos. Lave as lâminas três vezes em PBST, por 5 minutos por lavagem. Adicione 50 microlitros de BSA a 1.000 microlitros de PBST para obter uma solução de BSA a 5% e incube as lâminas em uma câmara úmida por 1 hora para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.
Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBS durante 5 minutos por lavagem. Diluir dois microlitros de anticorpo monoclonal de camundongo contra 8-hidroxi-desoxiguanosina e dois microlitros de anticorpo policlonal de coelho contra gama-H2AX em 296 microlitros de PBST, para obter uma solução de coquetel de anticorpos primários funcional.
Incube as amostras cardíacas com 50 microlitros da solução primária de coquetel de anticorpos, em uma câmara umidificada por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius.
Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBST durante 5 minutos por lavagem. Dilua 1 microlitro de anticorpo secundário anti-camundongo de cabra marcado com FITC e 1 microlitro de anticorpo secundário anti-coelho de cabra cy3 em 500 microlitros de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpo secundário funcional.
Incubar as amostras com os anticorpos secundários durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.
Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBS durante 5 minutos por lavagem. Adicione 20 microlitros de DAPI às amostras para coloração nuclear e incube-as por 30 minutos em temperatura ambiente. Aplique uma lamínula na lâmina e sele-a com esmalte para evitar ressecamento e movimento.
Visualize as amostras sob um microscópio de fluorescência e quantifique o sinal fluorescente da área do coração usando o software ImageJ. Calcule as mudanças relativas usando a média das amostras de controle DMSO e determine a significância estatística dos dados.