Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:57 min. • July 8th, 2025
No peixe-zebra, o material particulado fino do ambiente, ou PM - um poluente do ar - causa mau funcionamento cardíaco induzido pelo estresse oxidativo.
Para estudar o impacto do PM no peixe-zebra, comece expondo embriões de peixe-zebra à matéria orgânica extraível derivada de PM, EOM, que desencadeia a geração de espécies reativas de oxigênio, ou ROS.
ROS oxida a guanina base de DNA em 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina ou 8-OHdG e faz com que a fosforilação da histona H2AX forme γH2AX - um marcador para quebras de fita dupla de DNA.
Após a exposição, disseque o coração do peixe-zebra e coloque-o em uma lâmina de vidro. Trate o coração com uma solução fixadora que reticula as proteínas, estabilizando a estrutura celular.
Em seguida, adicione um reagente de bloqueio para evitar locais de ligação inespecíficos. Adicione anticorpos primários que têm como alvo γH2AX e 8-OHdG nas células cardíacas.
Em seguida, adicione dois anticorpos secundários marcados com fluorescência de cores diferentes que se ligam especificamente à região Fc de seu respectivo anticorpo primário. Finalmente, core a amostra com DAPI - uma coloração específica do DNA - que se liga ao sulco menor de sequências ricas em AT
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