Ensaio de agregação PolyQ para identificar o efeito neuroprotetor de um composto em vermes

Em alguns distúrbios neurodegenerativos, a proteína associada à doença compreende um trato expandido de poliglutamina, polyQ, - cadeia de resíduos consecutivos de glutamina - e é aberrantemente conformada. A conformação prejudicada desestabiliza a homeostase proteica, causando acúmulo de proteínas e formação de agregados tóxicos, levando à disfunção neuronal e morte.

Para rastrear a capacidade protetora de um composto de teste em aliviar a proteotoxicidade associada à agregação polyQ, obtenha uma suspensão de larvas transgênicas de Caenorhabditis elegans expressando proteínas poliQ marcadas com fluorescência em células musculares da parede corporal.

Pegue uma placa de vários poços contendo meios suplementados com alimentos bacterianos. Adicione o composto de teste em um conjunto de poços. Transfira as larvas para a placa de vários poços. Sele a placa para evitar a desidratação do meio e a contaminação microbiana. Incubar, permitindo que as larvas se transformem em adultos.

Durante o desenvolvimento, à medida que o nematóide envelhece, as proteínas polyQ se acumulam progressivamente dentro das células musculares e formam agregados.

Se o composto de teste estiver presente no meio, ele entra nas células musculares e, dependendo de sua capacidade protetora, pode exercer um efeito de agregação anti-polyQ, suprimindo e retardando a agregação de polyQ.

Colha os nematóides adultos e centrifugue. Ressuspenda os nematóides peletizados. Transfira para uma placa de vários poços. Imobilize os nematóides usando azida de sódio.

Usando um dispositivo de fluorescência de alta resolução, conte o ponto fluorescente, representando agregados poliQ, por nematóide.

Um número médio menor de agregados polyQ no tratamento do que nos poços de controle sugere uma maior capacidade protetora do composto de teste no alívio da proteotoxicidade associada à agregação polyQ.

Comece transferindo de 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematóides AM141 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microlitros de meio S contendo cepa OP50 de E. coli e cinco miligramas por mililitro de astragalano. Sele a placa com parafilme e incube-a a 20 graus Celsius e 120 rotações por minuto para intervalos de tempo desejados.

Transfira os nematóides em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e lave com tampão M9 três vezes por centrifugação, para remover as células OP50 restantes. Em seguida, ressuspenda os nematóides AM141 no tampão M9.

Agora, transfira de 10 a 15 nematóides para cada poço em uma placa de 384 poços, definindo 10 poços replicados para cada tratamento, e adicione 10 microlitros de azida sódica 200 milimolar a cada poço, para paralisar os nematóides, permitindo que eles se estabeleçam no fundo.

Coloque a placa em um sistema de imagem de alto conteúdo para adquirir imagens fluorescentes. Abra o software de aquisição de imagens e configure os parâmetros mencionados no manuscrito do texto. Analise os dados da imagem abrindo a janela "Review Plate Data" e selecionando a "Test Plate" para análise de imagem.

Clique duas vezes em um poço de teste para exibir sua imagem. Em seguida, selecione "Contar Núcleos" como método de análise e clique no botão "Definir Configurações". Defina a imagem de origem do canal FITC e selecione o "Algoritmo padrão".

Defina os parâmetros de análise de imagem conforme descrito no manuscrito do texto e teste-os para otimizar o método de análise. Salve as configurações e execute a análise em todos os poços. Exporte o "Total de Núcleos" como o número total de agregados Q40::YFP em cada poço.

Conte o número de nematóides em cada poço e calcule o número médio de agregados Q40::YFP por nematóide em cada grupo. Em seguida, calcule o índice de inibição.