Ensaio de ferida para avaliar a capacidade migratória de mioblastos murinos em co-cultura

Em resposta a uma ferida, as células secretoras produzem moléculas de sinalização parácrinas para ativar mioblastos - células musculares indiferenciadas. Os mioblastos ativados migram em direção ao local da ferida, onde proliferam, fazendo com que a ferida cicatrize.

Para avaliar a capacidade migratória dos mioblastos in vitro, pegue uma placa multipoços contendo uma monocamada confluente de mioblastos murinos. Usando uma ponta de pipeta, raspe a monocamada para criar um adesivo linear e sem células dentro do poço, que simula o local da ferida.

Complemente cuidadosamente o poço com o meio de crescimento sem perturbar o adesivo da ferida.

Pegue uma inserção membranosa contendo uma cultura aderente de células da crista neural, ou NCCs - células secretoras - em um meio adequado. Coloque a inserção dentro do poço, de modo que os NCCs na base fiquem próximos ao remendo da ferida. Incube a co-cultura pela duração desejada.

Durante a incubação, os NCCs liberam moléculas de sinalização que se ligam aos receptores específicos nos mioblastos, iniciando uma cascata de sinalização. Essa sinalização facilita a reorganização da actina nos mioblastos e, como resultado, essas células desenvolvem projeções citoplasmáticas, como lamelipódios e filopódios, em suas bordas. Essas projeções ajudam os mioblastos a migrar em direção à área ferida e repovoar gradualmente, levando à cicatrização de feridas.

Coloque a placa sob um microscópio e observe a cicatrização da ferida, cuja extensão se correlaciona com a capacidade migratória dos mioblastos em co-cultura.

Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, remova o meio sobrenadante do poço da câmara C2C12 e lave as células uma vez com PBS.

Depois de remover o PBS, comece a arranhar as células passando uma ponta de pipeta P10 estéril com firmeza, em uma única direção para abranger todo o comprimento ou largura da monocamada da célula. Assim que as células estiverem arranhadas, adicione rapidamente 1 mililitro de PBS.

Em seguida, ligue o computador e o microscópio. Coloque o slide da câmara no palco e gire o mostrador da objetiva para uma ampliação de 5X. Abra o software de imagem, clique na guia "Câmera" e, em seguida, clique no botão "Ao vivo" para visualizar as células na guia "AxioCam IC".

Certifique-se de que o filtro de luz seja puxado totalmente para fora para permitir que a luz passe para a câmera e a tela do computador. Mova ou gire manualmente a corrediça da câmara para posicionar a área da ferida no centro da imagem ao vivo na guia "AxioCam IC". Para tirar imagens, clique em "Snap" para abrir uma guia "Novo" ao lado da guia "AxioCam IC" que contém a imagem.

Para salvar esta imagem estática, clique em "Arquivo", selecione "Salvar como", selecione "Área de trabalho" na barra à esquerda para salvar o arquivo na área de trabalho. Digite o "Nome do arquivo" na caixa de nome do arquivo e salve a figura no formato de arquivo ".czi".

Para salvar a imagem como um ".tiff", clique em "Arquivo", selecione "Salvar como", digite o "Nome do arquivo" na caixa de nome do arquivo, clique no botão "Salvar como tipo" e selecione "*.tiff" no menu suspenso.

Reposicione manualmente a lâmina da câmara para tirar mais duas a três imagens em outros pontos da ferida no mesmo poço. Após a imagem, remova o PBS de cada poço e adicione 1 mililitro de meio C2C12.

Monte o sistema de co-cultura de inserção de poço colocando manualmente as inserções contendo as células O9-1 em cada poço do poço da câmara. Suavemente, empurre as inserções para baixo no poço de forma que a parte inferior da inserção fique logo acima das células C2C12 subjacentes. Retorne as construções de inserção de poço para a incubadora e permita que as células migrem por um total de 9 a 12 horas.

Para determinar o tempo ideal de migração, verifique as células seis horas após a criação da ferida e, em seguida, a cada duas ou três horas depois disso. Termine o experimento quando as células em condições de controle cobrirem completamente a ferida.