Ensaio de captação de aminoácidos radiomarcados para quantificar a captação celular de aminoácidos

Os transportadores de aminoácidos são proteínas ligadas à membrana que medeiam a transferência de aminoácidos através das membranas celulares, regulando os processos celulares vitais.

Para estudar a absorção de aminoácidos in vitro, faça uma cultura de células estromais derivadas da medula óssea de camundongos. Aspire o meio de crescimento. Adicione um tampão pré-aquecido suplementado com glutamina - um aminoácido - marcado com hidrogênio radioativo. Incube pela duração necessária.

O tampão pré-aquecido fornece temperatura fisiológica e um pH apropriado necessário para a absorção celular de glutamina. Os transportadores de glutamina consistem em domínios de transporte - responsáveis pela translocação do substrato via co-transporte acoplado a íons de sódio - e domínios de andaime ancorados na membrana.

O domínio de transporte se liga à glutamina radiomarcada junto com os íons de sódio do tampão. Ao se ligar, ele libera as moléculas no citoplasma. Simultaneamente, o domínio de transporte transloca íons de sódio intracelulares e aminoácidos neutros para fora da célula, resultando em homeostase celular.

Lave as células com tampão gelado, encerrando a reação e removendo qualquer glutamina extracelular radiomarcada. Adicione uma solução detergente. O detergente lisa as células, causando a liberação de glutamina intracelular radiomarcada.

Centrifugar o lisado. Adicione o sobrenadante contendo glutamina em um frasco com um coquetel de cintilação e coloque o frasco dentro de um balcão de cintilação.

As moléculas de glutamina radiomarcadas emitem partículas beta de alta energia. Os cintiladores do coquetel absorvem as partículas e emitem pulsos de luz que são detectados pelo contador de cintilação.

Meça a radioatividade para estimar a captação celular de glutamina.

Para iniciar o ensaio de captação de aminoácidos, coloque 5 x 10⁴ células ST2, em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços em meio alfa-MEM suplementado com FBS, penicilina e estreptomicina. Plaquear poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações.

Em seguida, incube as células em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois a três dias até confluir. Após a incubação, aspire o meio e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS a pH 7,4. Em seguida, aspire o PBS antes de lavar as células uma vez, com um mililitro de Krebs Ringers HEPES ou KRH.

Incubar as células com 0,5 mililitros de KRH recém-preparado contendo quatro microcuries por mililitro de meio de trabalho L-[3,4-3 H]-Glutamina por cinco minutos. Após a incubação, colete o meio radioativo para dispensar no recipiente de resíduos líquidos. Em seguida, lave as células três vezes com KRH gelado para encerrar a reação.

Em seguida, adicione um mililitro de dodecil sulfato de sódio a 1% em cada poço e triture a mistura 10 vezes para lisar e homogeneizar as células. Em seguida, transfira os lisados celulares para um tubo de 1,5 mililitro e clareie o lisado centrifugando a uma velocidade mínima de 10.000 g por 10 minutos.

Transfira o sobrenadante para um frasco de cintilação, contendo oito mililitros da solução de cintilação, e leia a radioatividade em contagens por minuto usando um contador de cintilação.

A partir das placas não radioativas restantes das células, tripsinize, ressuspenda e conte as células para estimar o número de células nas culturas radioativas lisadas. Usando um hemocitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental.