Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

Nas células vivas, em condições anaeróbicas, a enzima lactato desidrogenase converte o piruvato - um produto final da glicólise - em lactato - um metabólito chave. A quantidade de lactato produzida nas células reflete seu estado metabólico.

Para quantificar a concentração de lactato intracelular, comece com uma amostra de teste de lisado de células nematóides sem proteínas. Suplementar outros alvéolos de uma placa de vários poços com uma solução de lactato de várias concentrações conhecidas.

O lisado carece de todas as enzimas proteicas, incluindo lactato desidrogenase endógena, garantindo a quantificação precisa do lactato.

Adicione um tampão de ensaio de lactato em cada poço para manter o pH apropriado para uma atividade enzimática ideal. Suplementar os alvéolos com uma mistura de reação contendo a enzima lactato desidrogenase, nicotinamida-adenina dinucleotídeo - NAD - uma coenzima e uma sonda colorimétrica e incubar.

Durante a incubação, a lactato desidrogenase catalisa a oxidação do lactato celular em piruvato, com uma redução simultânea de NAD em NADH. O NADH gerado reage com a sonda colorimétrica para produzir um produto roxo.

Meça espectroscopicamente a absorbância da soluç