Ensaio de piruvato para estimativa dos níveis de piruvato em frações celulares de vermes

Os níveis celulares de piruvato - um intermediário chave nas vias bioquímicas de produção de energia - podem ser estimados usando ensaios colorimétricos baseados em enzimas.

Para determinar os níveis de piruvato nas células de Caenorhabditis elegans - um nematóide não parasita - pegue uma fração celular preparada a partir de vermes adultos contendo piruvato. Tratar a solução, retirando as proteínas celulares, e recolher a fracção celular clarificada — a amostra para ensaio — contendo o piruvato. A ausência de proteínas celulares garante uma determinação precisa dos níveis de piruvato.

Comece adicionando um reagente funcional contendo as enzimas piruvato oxidase e peroxidase de rábano e um corante cromogênico. Incubar a mistura no escuro durante um período adequado.

Durante a incubação, a piruvato oxidase reage com o piruvato - seu substrato - gerando peróxido de hidrogênio como subproduto. A ausência de luz impede a decomposição espontânea do peróxido de hidrogênio.

A peroxidase de rábano catalisa a reação entre o peróxido de hidrogênio e o corante cromogênico, produzindo um produto colorido. A intensidade do produto da reação colorida é diretamente proporcional à concentração de piruvato na amostra.

Após a conclusão do período de incubação, coloque a amostra dentro de um leitor de placas e meça a absorbância. Gere uma curva padrão usando uma diluição em série com concentrações conhecidas de piruvato.

Representar graficamente o valor de absorvância medido da amostra de ensaio na curva para determinar a concentração de piruvato na amostra de ensaio.

Use um kit de ensaio colorimétrico para medir a concentração de piruvato nas amostras de teste e faça exames duplex.

Adicione 10 microlitros das amostras de teste a diferentes poços de uma placa de 96 poços e adicione 90 microlitros de reagente de trabalho a cada amostra. Incubar coberto por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa em um leitor de microplacas para medir a absorbância de cada poço a 570 nanômetros.

Traçar a curva-padrão do piruvato e calcular as concentrações de piruvato a partir da curva-padrão, multiplicando cada concentração por 2,25.