Ensaio espectrofotométrico para determinar a atividade da glicogênio sintase

A glicogênio sintase - uma enzima crucial na síntese de glicogênio - cliva a glicose difosfato de uridina, ou UDP-glicose - um açúcar nucleotídico - em UDP e resíduo de glicosila e adiciona o monômero de glicose liberado à cadeia de glicogênio em crescimento.

Para estimar a atividade da glicogênio sintase, comece tomando uma mistura de reação contendo glicogênio, UDP-glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e nicotinamida adenina dinucleotídeo, ou NADH, em um tubo. Adicione o nucleosídeo difosfato, ou NDP, enzima quinase e um coquetel de enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase. Misture o conteúdo e incuba.

Adicione uma amostra contendo glicogênio sintase ao tubo para iniciar a reação enzimática.

A glicogênio sintase atua na UDP-glicose, gerando UDP e um resíduo de glicosil. A enzima absorve o monômero de glicose livre e o incorpora à cadeia de glicogênio da mistura de reação. Na presença de ATP, a NDP quinase da mistura de reação fosforila o UDP não utilizado, convertendo-o em UTP e gerando ADP.

A enzima piruvato quinase atua no ADP e adiciona um fosfato doado pelo fosfoenolpiruvato da mistura de reação para produzir ATP e piruvato. Em seguida, a lactato desidrogenase converte o piruvato em lactato e oxida o NADH durante a reação.

Meça a diminuição da absorbância do NADH a 340 nm para quantificar a quantidade de NADH consumida, o que indica atividade enzimática bem-sucedida.

Para começar com a determinação da atividade da glicogênio sintase, descongele as soluções de estoque previamente preparadas de UDP-glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP quinase em gelo. Pré-aqueça um banho-maria a 30 graus Celsius.

Quando as soluções-mãe estiverem prontas, preparar uma mistura de doseamento suficiente de acordo com o número de ensaios de glicogénio sintase, adicionando os reagentes a um tubo de 15 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto.

Prepare uma reação em branco substituindo o NADH da mistura de reação pela água e transfira a reação para uma cubeta de metacrilato descartável. Utilizar a reacção em branco para definir «Zero» no espectrofotómetro no comprimento de onda de 340 nanómetros.

Pegue uma alíquota de 770 microlitros da mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro e adicione sequencialmente 2 microlitros cada, de NDP quinase e mistura de piruvato quinase / lactato desidrogenase ao tubo.

Depois de misturar suavemente, incube o tubo a 30 graus Celsius no banho-maria, por 3 minutos para pré-aquecer a mistura de reação. Em seguida, adicione 30 microlitros da amostra contendo glicogênio sintase, em tampão Tris 20 milimolar a pH 7,8, e misture delicadamente antes de transferir a mistura de reação para uma cubeta de metacrilato descartável.

Colocar a cubeta no espectrofotómetro e registar a absorvância a 340 nanómetros a intervalos temporizados durante 10 a 20 minutos. Em seguida, plote as absorbâncias obtidas em relação ao tempo.