JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:00 min • July 8th, 2025
Durante a infecção pelo vírus influenza, o vírus entra na célula por endocitose e sequestra a maquinaria da célula hospedeira, produzindo vírions da progênie. Estes são liberados, infectando as células vizinhas, causando uma cascata de infecção.
Para medir a proporção entre o vírus infeccioso da gripe e as células em cultura — multiplicidade de infecções — adicionar uma densidade adequada de suspensão de células de mamíferos recém-obtidas numa placa de microtitulação.
A placa contém microeletrodos de ouro de medição de impedância embutidos no fundo do poço. Incubar, permitindo que as células adiram ao fundo do poço e atinjam a fase de crescimento exponencial antes da infecção.
Aplique um pequeno potencial elétrico entre os microeletrodos. As células aderidas aos microeletrodos atuam como isolantes, restringindo o fluxo de corrente e aumentando a resistência elétrica - impedância - que é medida.
Remova a mídia. Pipetar a suspensão do vírus da gripe para os poços. Suplemento com uma serina endoprotease adequada.
Durante a incubação, a serina endoprotease cliva e ativa a glicoproteína viral hemaglutinina, facilitando sua ligação a receptores específicos da célula hospedeira e subsequente entrada na célula viral.
Usando a maquinaria da célula hospedeira, novas partículas virais são produzidas e liberadas, infectando as células vizinhas. Como resultado, as células infectadas pelo vírus sofrem alterações morfológicas e exibem efeitos citopáticos, levando à morte celular - as células se desprendem da superfície do microeletrodo, diminuindo a impedância ao longo do tempo.
Determine o tempo necessário para que a impedância seja reduzida para metade da impedância inicial antes da adição do vírus. Um período de tempo mais curto sugere uma maior multiplicidade de infecções virais.
Para determinar a correlação entre os valores do CIT50 e a multiplicidade de infecção, após a cultura de 3 x 104 células MDCK recém-divididas em cada parede da placa de microtitulação eletrônica por 24 horas, lave as células duas vezes com 100 microlitros de meio de propagação de vírus fresco por poço por lavagem e use uma pipeta de canal único para adicionar 100 microlitros de suspensão viral a cada poço.
Quando todas as diluições do vírus tiverem sido adicionadas, carregue suavemente a placa no bolso do berço do instrumento a 35 graus Celsius e comece a monitorar a impedância da célula a cada 15 minutos por pelo menos 100 horas, conforme demonstrado.
Após dois ciclos de medições, clique para "Pausar" o aparelho e remova a placa E do suporte. Adicione 100 microlitros de meio de propagação do vírus suplementado com TPCK-tripsina a cada poço e retorne a placa da placa E para a bolsa do berço. Em seguida, inicie a análise.