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Técnicas Biológicas
0 vistas • 2:52 min • July 8th, 2025
Os vírus se ligam ao receptor da célula hospedeira e se internalizam em um endossomo. A membrana endossômica se funde com a membrana viral, liberando conteúdo viral dentro da célula.
Ao atingir o núcleo, o genoma viral se transcreve em mRNA e depois se traduz para formar proteínas virais. Os componentes virais entram no citoplasma e se reúnem em vírions, que se retiram da célula e causam efeitos citopáticos – mudanças na morfologia da célula hospedeira e morte.
Para avaliar a cinética de sobrevivência do vírus medindo a impedância da célula hospedeira, pegue uma placa multipoços revestida com microeletrodos de medição de impedância em sua parte inferior. Adicione uma suspensão de célula hospedeira aos poços e incube para permitir que as células adiram à superfície do eletrodo e cresçam.
Em seguida, tome suspensões virais pré-tratadas com solução salina com diferentes cargas virais. O tratamento com solução salina fornece cloreto ao vírus, que produz ácido hipocloroso que o mata – reduzindo a infectividade viral. Adicione essas suspensões virais em seus respectivos poços.
Meça a impedância celular - um fenômeno de oposição ao fluxo de corrente elétrica através dos eletrodos - pelas células aderentes.
Os vírus infectam as células hospedeiras aderentes e alteram sua morfologia, causando o desprendimento das células transformadas dos eletrodos. Com o tempo, à medida que mais células são infectadas, a impedância celular mediada pela célula hospedeira diminui.
Plote o índice celular, que é a mudança na impedância devido ao descolamento da célula infectada, ao longo do tempo.
Para avaliar a cinética de sobrevivência do vírus influenza A, adicione cloreto de sódio a uma concentração final de 35 gramas por litro em água destilada e adicione 900 microlitros da solução salina resultante a criotubos de 2 mililitros. Adicione 100 microlitros de estoque viral a cada criotubo e coloque os tubos na incubadora de 35 graus Celsius, pelo período de tempo experimental apropriado.
No dia anterior ao final da incubação, semeie 3 x 104 células MDCK recém-divididas em 100 microlitros de meio de propagação do vírus por poço, em uma placa de microtitulação de 16 poços, e repita as etapas permitindo a medição da impedância de fundo e distribuição uniforme das células no fundo dos poços. Em seguida, cultive as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, lave as células duas vezes, em seguida, infecte as células com 100 microlitros do vírus destilado com solução salina, diluído 10 vezes em meio de cultura fresco, conforme demonstrado, e monitore a impedância celular a cada 15 minutos por pelo menos 100 horas.