Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

As células geram baixos níveis de radicais livres durante os processos metabólicos.

Em condições patológicas, ocorre a superprodução de radicais livres, causando estresse oxidativo. Esses radicais livres atacam os ácidos graxos poliinsaturados nos fosfolipídios da membrana celular em um processo chamado peroxidação lipídica. Isso forma produtos de oxidação tóxicos, incluindo hidroperóxidos lipídicos e malondialdeído (MDA), que causam danos à membrana e morte celular.

Para detectar o estresse oxidativo no soro humano in vitro usando o ensaio de substância reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), comece com um tubo contendo soro humano tratado com um composto indutor de oxidação. O soro tratado compreende principalmente produtos de peroxidação lipídica - MDA e hidroperóxidos lipídicos - juntamente com fosfolipídios, lipídios e proteínas.

Em seguida, adicione dodecil sulfato de sódio (SDS) e misture para solubilizar os lipídios e liberar o MDA. O SDS desnatura quaisquer proteínas contaminantes. Adicione um tampão ácido adequado, seguido de ácido tiobarbitúrico ácido (TBA). Incubar a alta temperatura.

Sob condições ácidas e altas temperaturas, as moléculas de TBA reagem com o MDA, formando um complexo MDA-TBA vermelho-rosa estável, chamado TBARS. Incube no gelo para interromper a reação e estabilizar os complexos existentes.

centrifuga. Coletar e transferir o sobrenadante contendo MDA-TBA para uma placa de vários poços. Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância do complexo.

Uma maior absorbância sugere uma alta concentração de TBARS, o que indica níveis mais altos de produtos de peroxidação lipídica e estresse oxidativo no soro.

Rotule os tubos de vidro para as amostras a serem analisadas e, em seguida, adicione 100 microlitros da amostra preparada a cada tubo. Adicione 200 microlitros de SDS a 8,1% a cada amostra e gire suavemente o tubo de vidro em movimentos circulares para misturar.

Adicione 1,5 mililitros de tampão de acetato de sódio 3,5 molar a cada amostra. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de solução aquosa de ácido tiobarbitúrico a 0,8%. Traga o volume final em cada tubo para 4 mililitros adicionando 700 microlitros de água deionizada. Tampe bem os tubos de vidro e incuba-os em um bloco de aquecimento ajustado para 95 graus Celsius por 1 hora. Cubra os tubos com papel alumínio para evitar condensação. Em seguida, remova os tubos do bloco e incube-os no gelo por 30 minutos.

Após a incubação, centrifugue as amostras e os padrões a 1.500 x g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Transfira 150 microlitros de sobrenadante de cada tubo para um poço em uma placa de 96 poços, removendo quaisquer bolhas de ar com uma ponta de pipeta.

Meça a absorbância das amostras em 532 nanômetros. Em seguida, subtraia a leitura média de absorbância das amostras em branco de todas as outras leituras de absorbância.

Crie uma curva padrão e use-a para calcular concentrações de amostras desconhecidas.