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No olho dos mamíferos, a coroide, localizada entre a esclera e a retina, contém macrófagos perivasculares e o coriocapilar – uma camada de capilares sanguíneos revestidos por pericitos que fornece oxigênio e nutrientes para a retina. O vaso sanguíneo anormal que brota do coriocapilar ocorre em várias doenças oculares vasculares.
Para estudar o brotamento de coriocapilares desregulados ex vivo, tome explantes de olhos de camundongo colhidos contendo a coróide ligada à esclera e ao epitélio pigmentar da retina, ou RPE.
Adicione gotículas de extrato de membrana basal, ou BME - um hidrogel enriquecido em proteínas da matriz extracelular - aos poços de uma placa de vários poços. Coloque os explantes na gota, evitando o achatamento do tecido. Deixe o BME solidificar.
Adicione meio suplementado com células endoteliais ou fatores de crescimento específicos da CE. Incubar. O EPR secreta fator de crescimento endotelial vascular, que, juntamente com os fatores de crescimento específicos da CE, estimula a proliferação capilar da CE.
O BME solidificado forma uma matriz extracelular que promove os CEs em proliferação para formar túbulos capilares germinativos. Os pericitos migram e se ligam a esses capilares de brotação, facilitando a maturação dos CEs capilares.
Os macrófagos ativados na região de germinação secretam enzimas para digerir a membrana de Bruch - a camada coroidal mais interna - o que permite que os brotos migrem para o EPR.
Sob um microscópio, visualize os capilares brotando. Usando um software adequado, meça a área coberta pelo broto da coróide.
Uma área de brotamento coroidal maior indica brotamento progressivo de coriocapilar no explante.
Adicione 30 microlitros do BME descongelado no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forme uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas.
Coloque o tecido no meio do BME. Não alise o explante coróide. Deixe o tecido se expandir dentro do BME. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos para deixar o gel solidificar. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio clássico completo em cada poço. Mude o meio clássico a cada dois dias.
O brotamento da coróide pode ser observado após três dias com um microscópio. Abra a imagem de brotamento de coróide com a Imagem J e marque "Imagem | Tipo | e 8 bits" com tons de cinza. Em seguida, otimize o contraste selecionando "Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste" e ajustá-lo.
Use a função "Varinha Mágica" para delinear e remover o tecido coróide, que está presente no centro dos brotos. Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas.
Em seguida, vá para "Imagem | Ajustar | Limiar" e use a função "Limiar" para definir os brotos microvasculares contra o fundo e a periferia. Clique em "F2" e um resumo aparecerá. Clique em "Salvar" para salvar uma imagem da área selecionada na mesma pasta da imagem original para referência futura.
Depois que um grupo de amostras for medido, copie os dados registrados para análise.