Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

Os estrogênios são hormônios esteróides que atuam como moléculas de sinalização endócrina e se ligam a receptores nucleares - receptores de estrogênio beta, formando complexos de receptores de estrogênio-beta.

Esses complexos ligante-receptor dimerizam e formam homodímeros no citoplasma celular. O homodímero resultante entra no núcleo, liga-se ao elemento de resposta ao estrogênio, ERE - uma sequência de DNA específica dentro do promotor do gene alvo - e inicia a transcrição.

Para determinar a atividade estrogênica dos fitoestrogênios - metabólitos secundários derivados de plantas que imitam a função do estrogênio - comece com uma placa de vários poços contendo células repórter suspensas em um meio apropriado.

As células repórter são projetadas para superexpressar os receptores de estrogênio beta e transfectadas com um gene de luciferase fundido ao promotor ERE. Adicione a solução de amostra contendo fitoestrogênios e incuba.

Durante a incubação, o fitoestrogênio se liga aos receptores de estrogênio, beta - expressos nas células repórteres. Uma vez ligados, os complexos receptores de fitoestrogênio dimerizam e se translocam para o núcleo.

Dentro do núcleo, o complexo dimerizado se liga ao ERE. A ligação inicia a transcrição do gene da luciferase, produzindo a enzima luciferase. Em seguida, remova o meio e adicione um reagente contendo um substrato para luciferase. Incubar para permitir que a enzima luciferase expressa oxide seu substrato e produza luminescência.

Meça a luminescência, o que confirma a atividade estrogênica do composto na amostra.

Vórtice as amostras. Em seguida, adicione 4 microlitros de cada amostra a 496 microlitros de meio de triagem composto, para obter uma solução de DMSO a 0,8%.

Desinfete a superfície externa de um tubo de meio de recuperação de células pré-aquecido com etanol a 70% e transfira 10 mililitros do meio para um tubo de células repórter congeladas para descongelá-las. Feche o tubo das células repórter e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 5 a 10 minutos.

Depois de recuperar as células do banho-maria, inverta suavemente o tubo várias vezes para quebrar os agregados de células e produzir uma suspensão homogênea. Em seguida, limpe a superfície do tubo com etanol 70%.

Use uma pipeta multicanal para dispensar 100 microlitros da suspensão da célula repórter em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, dispense 100 microlitros de amostras em triplicata nos poços apropriados. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 22 a 24 horas.

Pouco antes do final da incubação da placa, remova o substrato de detecção e o tampão de detecção do refrigerador e coloque-os em uma área com pouca luz até que estejam equilibrados à temperatura ambiente. Em seguida, inverta suavemente cada tubo para misturar as soluções.

Imediatamente antes de a incubação da placa estar completa, despeje todo o conteúdo do tampão de detecção no tubo de substrato de detecção, para criar o reagente de detecção de luciferase. Misture o tubo delicadamente, para não produzir espuma.

Descarte o conteúdo da placa de amostra em um recipiente de lixo apropriado e bata suavemente em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços. Adicione 100 microlitros do reagente de detecção de luciferase a cada poço e deixe a placa de ensaio descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placas de 96 poços.